미오신 중쇄를 넘어선 인간 골격근 섬유의 이질성

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골격근은 주로 근섬유로 구성된 이질적인 조직이며, 인간의 근섬유는 일반적으로 세 가지 유형, 즉 "느린" 근섬유(1형)와 두 가지 "빠른" 근섬유(2A형 및 2X형)로 분류됩니다. 그러나 전통적인 근섬유 유형 간 및 유형 내의 이질성은 아직 제대로 이해되지 않고 있습니다. 본 연구에서는 인간 외측광근에서 추출한 1050개와 1038개의 개별 근섬유에 대해 각각 전사체 및 단백체 분석을 수행했습니다. 단백체 연구에는 남성이, 전사체 연구에는 남성 10명과 여성 2명이 참여했습니다. 미오신 중쇄 동형 단백질 외에도 대사 단백질, 리보솜 단백질, 세포 접합 단백질이 근섬유 간 다차원적 변이의 원인임을 확인했습니다. 또한, 느린 근섬유와 빠른 근섬유의 군집이 확인되었음에도 불구하고, 본 연구 결과는 2X형 근섬유가 다른 속근섬유와 표현형적으로 구별되지 않음을 시사합니다. 더 나아가, 미오신 중쇄 기반 분류는 네말린 근병증의 근섬유 표현형을 설명하기에 불충분합니다. 종합적으로, 우리의 데이터는 미오신 중쇄 동형 단백질을 넘어 다양한 변이 요인이 존재하는 다차원적인 근섬유 이질성을 시사합니다.
세포 이질성은 모든 생물학적 시스템의 고유한 특징으로, 세포가 조직과 세포의 다양한 요구를 충족하기 위해 특화될 수 있도록 합니다.¹ 골격근 섬유 이질성에 대한 전통적인 관점은 운동 뉴런이 운동 단위 내의 섬유 유형을 정의하고, 섬유 유형(예: 인간의 경우 1형, 2A형, 2X형)은 미오신 중쇄(MYH) 동형의 특성에 의해 결정된다는 것이었습니다.² 이는 초기에는 pH ATPase 불안정성에 기반했고,^3,4 이후에는 MYH의 분자 발현에 기반했습니다.⁵ 그러나 다양한 비율로 여러 MYH를 공동 발현하는 "혼합" 섬유가 확인되고 인정되면서, 골격근 섬유는 뚜렷하게 구분되는 섬유 유형보다는 연속체로 간주되는 경향이 커지고 있습니다.⁶ 그럼에도 불구하고, 이 분야는 여전히 근섬유 분류의 주요 기준으로 MYH에 크게 의존하고 있는데, 이는 MYH 발현 양상과 섬유 유형 범위가 인간과 다른 초기 설치류 연구의 한계와 상당한 편향에 영향을 받았을 가능성이 큽니다.² 상황은 다양한 인체 골격근이 다양한 섬유 유형을 나타낸다는 사실로 인해 더욱 복잡해집니다.7 대퇴외측근은 중간 정도의 (따라서 대표적인) MYH 발현 프로필을 가진 혼합 근육입니다.7 또한 샘플링이 용이하기 때문에 인체에서 가장 잘 연구된 근육입니다.
따라서 강력한 "오믹스" 도구를 사용하여 골격근 섬유 다양성을 편향 없이 조사하는 것은 매우 중요하지만, 골격근 섬유의 다핵성으로 인해 어려운 과제이기도 합니다. 그러나 최근 몇 년 동안 다양한 기술 발전으로 인해 전사체학8,9 및 단백체학10 기술의 감도가 혁신적으로 향상되어 단일 섬유 수준에서 골격근을 분석할 수 있게 되었습니다. 그 결과, 단일 섬유 다양성과 위축 자극 및 노화에 대한 반응을 규명하는 데 상당한 진전이 이루어졌습니다11,12,13,14,15,16,17,18. 더욱 중요한 것은 이러한 기술 발전이 임상적으로 응용될 수 있다는 점이며, 이를 통해 질병 관련 기능 이상을 더욱 상세하고 정확하게 규명할 수 있게 되었습니다. 예를 들어, 가장 흔한 유전성 근육 질환 중 하나인 네말린 근병증(MIM 605355 및 MIM 161800)의 병태생리는 복잡하고 혼란스럽습니다.19,20 따라서 골격근 섬유의 기능 장애를 더 잘 규명하면 이 질환에 대한 이해를 크게 향상시킬 수 있을 것입니다.
본 연구에서는 인체 생검 표본에서 수동으로 분리한 단일 골격근 섬유에 대한 전사체 및 단백질체 분석 방법을 개발하고 이를 수천 개의 섬유에 적용하여 인체 골격근 섬유의 세포 이질성을 조사했습니다. 이 연구를 통해 근섬유의 전사체 및 단백질체 표현형 분석의 유용성을 입증하고, 대사 단백질, 리보솜 단백질, 세포 접합 단백질이 섬유 간 변이의 중요한 원인임을 확인했습니다. 또한, 이 단백질체 분석 워크플로우를 이용하여 단일 골격근 섬유에서 선충 근병증의 임상적 중요성을 규명하고, MYH 발현을 기준으로 섬유 유형과 무관하게 비산화성 섬유로의 동시적인 변화를 밝혀냈습니다.
인간 골격근 섬유의 이질성을 조사하기 위해, 단일 골격근 섬유의 전사체 및 단백질체 분석을 가능하게 하는 두 가지 워크플로우를 개발했습니다(그림 1A 및 보충 그림 1A). 샘플 보관 및 RNA와 단백질 무결성 보존부터 각 접근 방식의 처리량 최적화에 이르기까지 여러 방법론적 단계를 개발하고 최적화했습니다. 전사체 분석의 경우, 역전사 초기 단계에서 샘플 특이적 분자 바코드를 삽입하여 96개의 섬유를 통합하여 효율적인 후속 처리를 수행할 수 있도록 했습니다. 기존의 단일 세포 접근 방식보다 더 깊은 시퀀싱(섬유당 약 1백만 개의 리드)을 통해 전사체 데이터를 더욱 풍부하게 만들었습니다. 단백질체 분석의 경우, 높은 처리량을 유지하면서 단백질체 깊이를 최적화하기 위해 timsTOF 질량 분석기에서 DIA-PASEF 데이터 수집과 결합된 짧은 크로마토그래피 기울기(21분)를 사용했습니다. 22,23 건강한 골격근 섬유의 이질성을 조사하기 위해, 우리는 건강한 성인 기증자 14명으로부터 얻은 1,050개의 개별 섬유의 전사체와 5명의 건강한 성인 기증자로부터 얻은 1,038개의 섬유의 단백질체를 분석했습니다(보충표 1). 본 논문에서는 이러한 데이터 세트를 각각 1,000개 섬유 전사체 및 단백질체라고 부릅니다. 우리의 접근 방식을 통해 1,000개 섬유 전사체 및 단백질체 분석에서 총 27,237개의 전사체와 2,983개의 단백질이 검출되었습니다(그림 1A, 보충 데이터 세트 1-2). 전사체 및 단백질체 데이터 세트에서 검출된 유전자 수가 1,000개 이상이고 유효값이 50% 이상인 섬유를 필터링한 후, 전사체에서는 925개, 단백질체에서는 974개의 섬유에 대해 후속 생물정보학 분석을 수행했습니다. 필터링 후, 섬유당 평균 4257 ± 1557개의 유전자와 2015 ± 234개의 단백질(평균 ± 표준편차)이 검출되었으며, 개인 간 변동성은 제한적이었다(보충 그림 1B–C, 보충 데이터 세트 3–4). 그러나 참가자 내 변동성은 더 두드러졌는데, 이는 섬유 길이와 단면적의 차이로 인한 RNA/단백질 수율의 차이 때문일 가능성이 높다. 대부분의 단백질(2000개 이상)에 대해 변동 계수는 20% 미만이었다(보충 그림 1D). 두 가지 방법 모두 근육 수축에 중요한 고발현 특징을 가진 전사체와 단백질의 광범위한 동적 범위를 포착할 수 있었다(예: ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3)(보충 그림 1E–F). 식별된 특징의 대부분은 전사체 데이터셋과 단백질체 데이터셋 간에 공통적이었으며(보충 그림 1G), 이러한 특징의 평균 UMI/LFQ 강도는 상당히 높은 상관관계를 보였다(r = 0.52)(보충 그림 1H).
전사체학 및 단백체학 워크플로우(BioRender.com으로 제작). BD MYH7, MYH2, MYH1에 대한 동적 범위 곡선 및 섬유 유형 할당을 위한 계산된 임계값. E, F 전사체학 및 단백체학 데이터 세트에서 섬유 전반에 걸친 MYH 발현 분포. G, H MYH 기반 섬유 유형별로 색칠된 전사체학 및 단백체학에 대한 UMAP(Uniform Diversity Approximation and Projection) 플롯. I, J 전사체학 및 단백체학 데이터 세트에서 MYH7, MYH2, MYH1 발현을 보여주는 특징 플롯.
본 연구에서는 오믹스 데이터 세트에서 MYH 발현의 높은 민감도와 동적 범위를 활용하는 최적화된 접근 방식을 사용하여 각 섬유에 MYH 기반 섬유 유형을 할당하는 것을 목표로 삼았습니다. 이전 연구에서는 다양한 MYH의 고정된 발현 비율을 기준으로 섬유를 순수 1형, 2A형, 2X형 또는 혼합형으로 분류하기 위해 임의의 임계값을 사용했습니다.^11,14,24 본 연구에서는 각 섬유의 발현량을 섬유 유형 분류에 사용한 MYH(1형, 2A형, 2X형에 해당하는 MYH7, MYH2, MYH1)에 따라 순위를 매기는 다른 접근 방식을 사용했습니다. 그런 다음 각 곡선의 하단 변곡점을 수학적으로 계산하고 이를 임계값으로 사용하여 각 MYH에 대해 섬유를 양성(임계값 이상) 또는 음성(임계값 미만)으로 분류했습니다(그림 1B–D). 이 데이터는 MYH7(그림 1B)과 MYH2(그림 1C)가 단백질 수준에 비해 RNA 수준에서 더 뚜렷한 발현 양상을 보인다는 것을 보여줍니다. 실제로 단백질 수준에서는 MYH7을 발현하지 않는 섬유는 거의 없었고, MYH2 발현이 100%인 섬유는 없었습니다. 다음으로, 미리 정해진 발현 임계값을 사용하여 각 데이터 세트의 모든 섬유에 MYH 기반 섬유 유형을 할당했습니다. 예를 들어, MYH7+/MYH2-/MYH1- 섬유는 유형 1로, MYH7-/MYH2+/MYH1+ 섬유는 혼합형 2A/2X로 할당했습니다(자세한 내용은 보충표 2 참조). 모든 섬유를 통합하여 분석한 결과, RNA 수준(그림 1E)과 단백질 수준(그림 1F) 모두에서 MYH 기반 섬유 유형의 분포가 매우 유사한 반면, MYH 기반 섬유 유형의 상대적 구성은 예상대로 개인마다 차이가 있음을 관찰했습니다(보충 그림 2A). 대부분의 섬유는 순수 1형(34~35%) 또는 2A형(36~38%)으로 분류되었지만, 혼합형 2A/2X 섬유도 상당수(16~19%) 검출되었다. 주목할 만한 차이점은 순수 2X형 섬유는 RNA 수준에서만 검출되고 단백질 수준에서는 검출되지 않았다는 점인데, 이는 MYH의 빠른 발현이 적어도 부분적으로는 전사 후 조절을 받는다는 것을 시사한다.
본 연구에서 개발한 단백질체 기반 MYH 섬유 유형 분류법을 항체 기반 도트 블로팅법으로 검증한 결과, 두 방법 모두 순수 1형 및 2A형 섬유를 식별하는 데 100% 일치율을 보였습니다(보충 그림 2B 참조). 그러나 단백질체 기반 접근법은 혼합 섬유를 식별하고 각 섬유에서 각 MYH 유전자의 비율을 정량화하는 데 있어 더 높은 민감도와 효율성을 나타냈습니다. 이러한 결과는 객관적이고 높은 민감도를 가진 오믹스 기반 접근법을 이용하여 골격근 섬유 유형을 특성화하는 것이 효과적임을 보여줍니다.
우리는 전사체와 단백체에서 얻은 정보를 결합하여 근섬유의 전체 전사체 또는 단백체를 기반으로 객관적으로 분류했습니다. 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP) 방법을 사용하여 차원을 6개의 주성분으로 축소함으로써(보충 그림 3A-B), 전사체(그림 1G)와 단백체(그림 1H)에서 근섬유의 변이성을 시각화할 수 있었습니다. 특히, 전사체 및 단백체 데이터 세트 모두에서 근섬유는 참가자(보충 그림 3C-D) 또는 검사일(보충 그림 3E)에 따라 그룹화되지 않았는데, 이는 골격근 섬유의 개인 내 변이성이 개인 간 변이성보다 크다는 것을 시사합니다. UMAP 플롯에서는 "빠른" 근섬유와 "느린" 근섬유를 나타내는 두 개의 뚜렷한 클러스터가 나타났습니다(그림 1G-H). MYH7+ (느린) 근섬유는 UMAP1의 양극에, MYH2+ 및 MYH1+ (빠른) 근섬유는 UMAP1의 음극에 군집을 이루었습니다(그림 1I–J). 그러나 MYH 발현을 기준으로 빠른 수축 근섬유 유형(즉, 2A형, 2X형 또는 혼합형 2A/2X)을 구분할 수 없었는데, 이는 MYH1(그림 1I–J) 또는 ACTN3이나 MYLK2와 같은 다른 고전적인 2X 근섬유 마커(보충 그림 4A–B)의 발현이 전체 전사체 또는 단백질체를 고려할 때 서로 다른 근섬유 유형을 구별하지 못한다는 것을 시사합니다. 더욱이, MYH2 및 MYH7과 비교했을 때 MYH1과 양의 상관관계를 보이는 전사체 또는 단백질은 거의 없었으며(보충 그림 4C–H), 이는 MYH1의 풍부도가 근섬유 전사체/단백질체를 완전히 반영하지 못한다는 것을 나타냅니다. UMAP 수준에서 세 가지 MYH 동형 단백질의 혼합 발현을 평가했을 때도 유사한 결론에 도달했습니다(보충 그림 4I–J). 따라서 MYH 정량화만으로는 전사체 수준에서 2X 섬유를 식별할 수 있지만, 전체 전사체 또는 단백질체를 고려할 때는 MYH1+ 섬유를 다른 속근 섬유와 구별할 수 없습니다.
MYH를 넘어선 느린 근섬유의 이질성을 초기 탐색하기 위해, 우리는 TPM3, TNNT1, MYL3, ATP2A22 등 네 가지 기존 느린 근섬유 유형 특이적 단백질을 평가했습니다. 느린 근섬유 하위 유형들은 전사체 분석(보충 그림 5A)과 단백체 분석(보충 그림 5B) 모두에서 MYH7과 높은 피어슨 상관관계를 보였지만, 완벽한 상관관계는 아니었습니다. 전사체 분석(보충 그림 5C)과 단백체 분석(보충 그림 5D)에서 각각 약 25%와 33%의 느린 근섬유가 모든 유전자/단백질 하위 유형에 의해 순수 느린 근섬유로 분류되지 않았습니다. 따라서, 여러 유전자/단백질 하위 유형을 기반으로 한 느린 근섬유 분류는 근섬유 유형 특이적인 것으로 알려진 단백질의 경우에도 추가적인 복잡성을 야기합니다. 이는 단일 유전자/단백질 계열의 동형 단백질을 기반으로 한 근섬유 분류가 골격근 섬유의 진정한 이질성을 적절하게 반영하지 못할 수 있음을 시사합니다.
전체 오믹스 모델 규모에서 인간 골격근 섬유의 표현형 다양성을 더 자세히 탐구하기 위해 주성분 분석(PCA)을 사용하여 데이터의 비편향 차원 축소를 수행했습니다(그림 2A). UMAP 플롯과 유사하게, 참가자나 검사일은 PCA 수준에서 섬유 클러스터링에 영향을 미치지 않았습니다(보충 그림 6A-C). 두 데이터 세트 모두에서 MYH 기반 섬유 유형은 PC2로 설명되었으며, PC2는 느린 수축형 1형 섬유 클러스터와 빠른 수축형 2A형, 2X형, 그리고 혼합형 2A/2X 섬유를 포함하는 두 번째 클러스터를 보여주었습니다(그림 2A). 두 데이터 세트 모두에서 이 두 클러스터는 소수의 혼합형 1/2A 섬유에 의해 연결되었습니다. 예상대로, 주요 PC 동인에 대한 과대표 분석은 PC2가 수축 및 대사적 특징에 의해 좌우됨을 확인했습니다(그림 2B 및 보충 그림 6D-E, 보충 데이터 세트 5-6). 전반적으로, MYH 기반 섬유 유형은 PC2를 따라 연속적인 변이를 설명하기에 충분한 것으로 나타났으며, 빠른 클러스터 내의 전사체 전체에 분포된 소위 2X 섬유는 예외였습니다.
A. MYH를 기반으로 섬유 유형에 따라 색상이 지정된 전사체 및 단백질체 데이터 세트의 주성분 분석(PCA) 플롯. B. PC2 및 PC1에서 전사체 및 단백질 동인에 대한 풍부도 분석. 통계 분석은 clusterProfiler 패키지와 Benjamini-Hochberg 보정 p값을 사용하여 수행되었습니다. C, D. 전사체에서는 세포간 접착 유전자 온톨로지(GO) 용어에 따라, 단백질체에서는 costamere GO 용어에 따라 색상이 지정된 PCA 플롯. 화살표는 전사체 및 단백질 동인과 그 방향을 나타냅니다. E, F. 느린/빠른 섬유 유형과 무관한 발현 기울기를 보여주는 임상적으로 관련된 특징의 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP) 특징 플롯. G, H. 전사체 및 단백질체에서 PC2 및 PC1 동인 간의 상관관계.
예상과는 달리, MYH 기반 근섬유 유형은 두 번째로 높은 변동성(PC2)만을 설명했는데, 이는 MYH 기반 근섬유 유형(PC1)과 관련 없는 다른 생물학적 요인들이 골격근 섬유 이질성 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. PC1의 주요 요인에 대한 과대표 분석 결과, PC1의 변동성은 전사체에서는 세포 간 접착력과 리보솜 함량, 단백질체에서는 코스타미어와 리보솜 단백질에 의해 주로 결정되는 것으로 나타났습니다(그림 2B 및 보충 그림 6D-E, 보충 데이터 세트 7). 골격근에서 코스타미어는 Z-원반과 근형질막을 연결하며 힘 전달 및 신호 전달에 관여합니다.25 세포 간 접착력(전사체, 그림 2C) 및 코스타미어(단백질체, 그림 2D) 특징을 사용한 주석이 달린 PCA 플롯은 PC1의 강한 좌측 이동을 보여주는데, 이는 이러한 특징들이 특정 섬유에 풍부하게 존재함을 나타냅니다.
UMAP 수준에서 근섬유 클러스터링을 보다 자세히 분석한 결과, 대부분의 특징들이 근섬유 하위 클러스터 특이적이기보다는 근섬유 유형에 독립적인 MYH 기반 발현 기울기를 나타내는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 연속성은 CHCHD10(신경근육 질환), SLIT3(근육 위축), CTDNEP1(근육 질환)과 같은 병리학적 상태와 관련된 여러 유전자에서 관찰되었습니다(그림 2E). 또한, 이러한 연속성은 신경계 질환 관련 단백질(UGDH), 인슐린 신호 전달 관련 단백질(PHIP), 전사 관련 단백질(HIST1H2AB)을 포함한 단백질체 전반에 걸쳐 관찰되었습니다(그림 2F). 종합적으로, 이러한 데이터는 서로 다른 근섬유에서 근섬유 유형에 독립적인 느린/빠른 수축 이질성의 연속성을 시사합니다.
흥미롭게도, PC2의 드라이버 유전자들은 전사체-단백질체 상관관계가 양호하게 나타났습니다(r = 0.663)(그림 2G). 이는 느린 근섬유와 빠른 근섬유 유형, 특히 골격근 섬유의 수축 및 대사 특성이 전사적으로 조절됨을 시사합니다. 그러나 PC1의 드라이버 유전자들은 전사체-단백질체 상관관계가 나타나지 않았습니다(r = -0.027)(그림 2H). 이는 느린/빠른 근섬유 유형과 관련 없는 변이들이 주로 전사 후 조절을 받는다는 것을 시사합니다. PC1의 변이가 주로 리보솜 유전자 온톨로지 용어로 설명되었고, 리보솜이 단백질 번역에 적극적으로 참여하고 영향을 미침으로써 세포에서 중요하고 특화된 역할을 수행한다는 점을 고려하여,31 우리는 다음으로 이러한 예상치 못한 리보솜 이질성을 조사하기 시작했습니다.
먼저, GOCC 용어인 "세포질 리보솜"에 포함된 단백질의 상대적 풍부도에 따라 단백질체 주성분 분석(PCA) 플롯에 색을 입혔습니다(그림 3A). 이 용어는 PC1의 양의 쪽에 풍부하게 나타나 작은 기울기를 형성하지만, 리보솜 단백질은 PC1의 양방향 분할을 주도합니다(그림 3A). PC1의 음의 쪽에 풍부하게 나타난 리보솜 단백질에는 RPL18, RPS18, RPS13이 포함되었고(그림 3B), 양의 쪽에서는 RPL31, RPL35, RPL38이 주요 주도 단백질이었습니다(그림 3C). 흥미롭게도, RPL38과 RPS13은 다른 조직에 비해 골격근에서 높은 발현량을 보였습니다(보충 그림 7A). PC1에서 나타난 이러한 특징적인 리보솜 단백질 발현 양상은 전사체에서는 관찰되지 않았으며(보충 그림 7B), 이는 전사 후 조절을 시사합니다.
A. 세포질 리보솜 유전자 온톨로지(GO) 용어에 따라 색상이 지정된 주성분 분석(PCA) 플롯. 화살표는 PCA 플롯에서 단백질 매개 변이의 방향을 나타냅니다. 선의 길이는 특정 단백질에 대한 주성분 점수에 해당합니다. B, C. RPS13 및 RPL38에 대한 PCA 특징 플롯. D. 세포질 리보솜 단백질의 비지도 계층적 클러스터링 분석. E. 골격근 섬유에서 풍부도가 다른 리보솜 단백질을 강조 표시한 80S 리보솜 구조 모델(PDB: 4V6X). F. mRNA 출구 채널 근처에 위치한 다양한 비율의 리보솜 단백질.
이전에 리보솜 이질성과 특수화 개념이 제안되었는데, 서로 다른 리보솜 하위 집단(리보솜 이질성)의 존재는 특정 mRNA 전사체 풀의 선택적 번역(리보솜 특수화)을 통해 다양한 조직32 및 세포33에서 단백질 번역에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 골격근 섬유에서 공동 발현되는 리보솜 단백질 하위 집단을 식별하기 위해, 우리는 프로테옴 내 리보솜 단백질에 대한 비지도 계층적 클러스터링 분석을 수행했습니다(그림 3D, 보충 데이터 세트 8). 예상대로, 리보솜 단백질은 MYH를 기반으로 섬유 유형별로 클러스터링되지 않았습니다. 그러나 우리는 세 가지의 서로 다른 리보솜 단백질 클러스터를 식별했습니다. 첫 번째 클러스터(ribosomal_cluster_1)는 RPL38과 공동 조절되므로 PC1 프로필이 양성인 섬유에서 발현이 증가합니다. 두 번째 클러스터(ribosomal_cluster_2)는 RPS13과 공동 조절되며 PC1 프로필이 음성인 섬유에서 발현이 증가합니다. 세 번째 클러스터(ribosomal_cluster_3)는 골격근 섬유에서 조화로운 차등 발현을 보이지 않으며 "핵심" 골격근 리보솜 단백질로 간주될 수 있습니다. 리보솜 클러스터 1과 2는 모두 이전에 대체 번역을 조절하는 것으로 밝혀진 리보솜 단백질(예: RPL10A, RPL38, RPS19 및 RPS25)과 발달에 기능적으로 영향을 미치는 것으로 밝혀진 리보솜 단백질(예: RPL10A, RPL38)을 포함합니다.34,35,36,37,38 PCA 결과와 일관되게, 섬유 전체에 걸쳐 관찰된 이러한 리보솜 단백질의 이질적인 표현은 연속성도 보였습니다(보충 그림 7C).
리보솜 내 이질적인 리보솜 단백질의 위치를 ​​시각화하기 위해 인간 80S 리보솜의 구조 모델(단백질 데이터 뱅크: 4V6X)을 사용했습니다(그림 3E). 서로 다른 리보솜 클러스터에 속하는 리보솜 단백질을 분리한 후, 이들의 위치가 밀접하게 정렬되지 않았는데, 이는 우리의 접근 방식이 리보솜의 특정 영역/부분을 농축하는 데 실패했음을 시사합니다. 그러나 흥미롭게도 클러스터 2의 대형 소단위 단백질 비율은 클러스터 1 및 3보다 낮았습니다(보충 그림 7D). 골격근 섬유에서 화학양론적으로 변형된 단백질은 주로 리보솜 표면에 국소화되어 있는 것을 관찰했는데(그림 3E), 이는 이러한 단백질이 서로 다른 mRNA 집단의 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소와 상호작용하여 선택적 번역을 조절하는 능력과 일치합니다. 40, 41 또한, 골격근 섬유에서 화학양론이 변형된 많은 단백질은 mRNA 출구 터널(그림 3F)과 같은 기능적 영역 근처에 위치하며, 이는 특정 펩타이드의 번역 연장 및 정지를 선택적으로 조절합니다. 42 요약하면, 우리의 데이터는 골격근 리보솜 단백질의 화학양론이 이질성을 나타내며, 이로 인해 골격근 섬유 간에 차이가 발생함을 시사합니다.
다음으로, 속근섬유와 지근섬유의 특징을 규명하고 이들의 전사 조절 기전을 탐구하고자 했습니다. 두 데이터 세트에서 UMAP으로 정의된 속근섬유와 지근섬유 클러스터를 비교한 결과(그림 1G–H 및 4A–B), 전사체 및 단백체 분석을 통해 각각 1366개와 804개의 차등 발현 특징을 확인했습니다(그림 4A–B, 보충 데이터 세트 9–12). 근절(예: 트로포미오신 및 트로포닌), 흥분-수축 연결(SERCA 동형 단백질), 에너지 대사(예: ALDOA 및 CKB)와 관련된 특징에서 예상되는 차이가 관찰되었습니다. 또한, 단백질 유비퀴틴화를 조절하는 전사체와 단백질(예: USP54, SH3RF2, USP28 및 USP48)이 속근섬유와 지근섬유에서 차등 발현되었습니다(그림 4A–B). 또한, 이전에 어린 양의 근섬유 유형 전반에 걸쳐 차등적으로 발현되는 것으로 나타났고43 심장 근육에서 SERCA 활성을 향상시키는 것으로 알려진44 미생물 단백질 유전자 RP11-451G4.2(DWORF)가 느린 골격근 섬유에서 유의하게 상향 조절되었습니다(그림 4A). 마찬가지로, 개별 섬유 수준에서도 대사 관련 젖산 탈수소효소 동형(LDHA 및 LDHB, 그림 4C 및 보충 그림 8A)45,46과 같은 알려진 특징뿐만 아니라 이전에 알려지지 않은 섬유 유형 특이적 특징(IRX3, USP54, USP28 및 DPYSL3 등)에서도 유의한 차이가 관찰되었습니다(그림 4C). 전사체 및 단백체 데이터 세트 간에는 차등 발현 특징이 상당히 중복되었으며(보충 그림 8B), 주로 근절 특징의 더욱 두드러진 차등 발현에 의해 좌우되는 배율 변화 상관관계가 나타났습니다(보충 그림 8C). 특히 일부 시그니처(예: USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13)는 단백질 수준에서만 강력한 전사 후 조절을 보였으며 느린/빠른 수축 섬유 유형별 발현 프로파일을 나타냈습니다(보충 그림 8C).
A와 B는 그림 1G~H의 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP) 플롯으로 식별된 느린 클러스터와 빠른 클러스터를 비교하는 화산 플롯입니다. 색깔 있는 점은 FDR < 0.05에서 유의미한 차이를 보이는 전사체 또는 단백질을 나타내고, 진한 점은 log 변화 > 1에서 유의미한 차이를 보이는 전사체 또는 단백질을 나타냅니다. 이원 통계 분석은 DESeq2 Wald 검정과 Benjamini-Hochberg 보정 p값(전사체) 또는 경험적 베이지안 분석 후 Benjamini-Hochberg 다중 비교 보정을 적용한 Limma 선형 모델 방법(단백체)을 사용하여 수행했습니다. C는 느린 섬유와 빠른 섬유 간에 차등 발현되는 유전자 또는 단백질의 시그니처 플롯입니다. D는 유의미하게 차등 발현되는 전사체와 단백질의 풍부도 분석입니다. 겹치는 값은 두 데이터 세트 모두에서 풍부하게 나타나고, 전사체 값은 전사체에서만, 단백체 값은 단백체에서만 풍부하게 나타납니다. 통계 분석은 Benjamini-Hochberg 보정 p값을 사용하여 clusterProfiler 패키지로 수행되었습니다. E. SCENIC에서 도출된 조절자 특이성 점수와 섬유 유형 간의 차등 mRNA 발현을 기반으로 SCENIC에 의해 식별된 섬유 유형별 전사 인자. F. 느린 섬유와 빠른 섬유 간에 차등적으로 발현되는 선택된 전사 인자의 프로파일링.
다음으로, 차등적으로 표현된 유전자와 단백질에 대한 과잉 표현 분석을 수행했습니다(그림 4D, 보충 데이터 세트 13). 두 데이터 세트 간에 차이가 있는 특징에 대한 경로 풍부화 분석 결과, 지방산 β-산화 및 케톤 대사 과정(느린 섬유), 근섬유/근육 수축(각각 빠른 섬유와 느린 섬유), 탄수화물 이화 과정(빠른 섬유)과 같은 예상되는 차이가 나타났습니다. 세린/트레오닌 단백질 인산가수분해효소 활성 또한 빠른 섬유에서 증가했는데, 이는 글리코겐 대사를 조절하는 것으로 알려진 조절 및 촉매 인산가수분해효소 소단위(PPP3CB, PPP1R3D 및 PPP1R3A)와 같은 특징에 의해 유도되었습니다(47)(보충 그림 8D-E). 빠른 섬유에서 풍부하게 나타난 다른 경로에는 프로테옴의 프로세싱(P-) 바디(YTHDF3, TRIM21, LSM2)(보충 그림 8F)가 포함되었으며, 이는 전사 후 조절(48)에 관여할 가능성이 있고, 전사체에서는 전사 인자 활성(SREBF1, RXRG, RORA)(보충 그림 8G)이 나타났습니다. 느린 섬유에서는 산화환원효소 활성(BDH1, DCXR, TXN2)(보충 그림 8H), 아미드 결합(CPTP, PFDN2, CRYAB)(보충 그림 8I), 세포외 기질(CTSD, ADAMTSL4, LAMC1)(보충 그림 8J) 및 수용체-리간드 활성(FNDC5, SPX, NENF)(보충 그림 8K)이 풍부하게 나타났습니다.
느린 근섬유와 빠른 근섬유 유형 특성의 기저에 있는 전사 조절에 대한 더 깊은 이해를 얻기 위해 SCENIC49를 사용하여 전사 인자 풍부도 분석을 수행했습니다(보충 자료 세트 14). 많은 전사 인자가 빠른 근섬유와 느린 근섬유 사이에서 유의미하게 풍부하게 나타났습니다(그림 4E). 여기에는 이전에 빠른 근섬유 발달과 관련이 있는 것으로 알려진 MAFA50와 같은 전사 인자뿐만 아니라 이전에 근섬유 유형 특이적 유전자 프로그램과 관련이 없었던 여러 전사 인자가 포함되었습니다. 이들 중 PITX1, EGR1 및 MYF6는 빠른 근섬유에서 가장 풍부하게 나타난 전사 인자였습니다(그림 4E). 반대로 ZSCAN30과 EPAS1(HIF2A라고도 함)은 느린 근섬유에서 가장 풍부하게 나타난 전사 인자였습니다(그림 4E). 이와 일관되게 MAFA는 빠른 근섬유에 해당하는 UMAP 영역에서 더 높은 수준으로 발현되었고, EPAS1은 반대의 발현 패턴을 보였습니다(그림 4F).
알려진 단백질 코딩 유전자 외에도 인간 발달 및 질병 조절에 관여할 수 있는 수많은 비코딩 RNA 생물형이 존재합니다. 51, 52 전사체 데이터 세트에서 여러 비코딩 RNA는 근섬유 유형 특이성을 나타냅니다(그림 5A 및 보충 데이터 세트 15). 여기에는 느린 근섬유에 매우 특이적이며 미토콘드리아 근병증 환자의 근육에서 감소하는 것으로 보고된 LINC01405가 포함됩니다. 53 반면, lnc-ERCC5-5 유전자(https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54에 해당하는 RP11-255P5.3은 빠른 근섬유 유형 특이성을 나타냅니다. LINC01405(https://tinyurl.com/x5k9wj3h)와 RP11-255P5.3(https://tinyurl.com/29jmzder)은 모두 골격근 특이성을 나타내며(보충 그림 9A-B), 1Mb의 유전체 영역 내에 알려진 수축 관련 유전자가 없어, 인접한 수축 관련 유전자를 조절하기보다는 근섬유 유형을 조절하는 데 특화된 역할을 하는 것으로 추정된다. LINC01405와 RP11-255P5.3의 각각 느린/빠른 근섬유 유형 특이적 발현 양상은 RNAscope를 사용하여 확인되었다(그림 5B-C).
A. 비코딩 RNA 전사체는 느린 근섬유와 빠른 근섬유에서 유의미하게 조절됩니다. B. LINC01405와 RP11-255P5.3의 느린 근섬유 및 빠른 근섬유 유형 특이성을 각각 보여주는 대표적인 RNAscope 이미지. 스케일 바 = 50 μm. C. RNAscope를 이용하여 측정한 근섬유 유형별 비코딩 RNA 발현량 정량화 (각 개인 내 빠른 근섬유와 느린 근섬유를 비교한 독립적인 개인으로부터 얻은 생검 샘플 3개). 통계 분석은 양측 검정 Student's t-검정을 사용하여 수행했습니다. 박스 플롯은 중앙값과 제1사분위수 및 제3사분위수를 나타내며, 수염은 최소값과 최대값을 가리킵니다. D. 새로운 미생물 단백질 식별 워크플로 (BioRender.com으로 생성). E. 미생물 단백질 LINC01405_ORF408:17441:17358은 느린 골격근 섬유에서 특이적으로 발현됩니다(독립적인 참가자 5명의 생검 샘플을 사용하여 각 참가자의 빠른 근섬유와 느린 근섬유를 비교). 통계 분석은 경험적 베이지안 접근법과 결합된 Limm 선형 모델 방법을 사용하여 수행되었으며, 다중 비교를 위해 p값 조정을 포함한 Benjamini-Hochberg 방법을 적용했습니다. 상자 그림은 중앙값, 제1사분위수 및 제3사분위수를 나타내며, 수염은 최대값/최소값을 가리킵니다.
최근 연구에 따르면 많은 비코딩 전사체가 전사된 미생물 단백질을 암호화하며, 이들 중 일부는 근육 기능을 조절하는 것으로 나타났습니다. 44, 55 잠재적인 섬유 유형 특이성을 가진 미생물 단백질을 식별하기 위해, 1000개 섬유 전사체 데이터 세트에서 발견된 비코딩 전사체(n = 305)의 서열을 포함하는 맞춤형 FASTA 파일을 사용하여 1000개 섬유 프로테옴 데이터 세트를 검색했습니다(그림 5D). 22개의 서로 다른 전사체에서 197개의 미생물 단백질을 식별했으며, 이 중 71개는 느린 골격근 섬유와 빠른 골격근 섬유 간에 차등적으로 조절되었습니다(보충 그림 9C 및 보충 데이터 세트 16). LINC01405의 경우, 세 가지 미생물 단백질 산물이 확인되었으며, 그중 하나는 해당 전사체와 유사한 느린 섬유 특이성을 보였습니다(그림 5E 및 보충 그림 9D). 따라서 우리는 LINC01405를 느린 골격근 섬유에 특이적인 미생물 단백질을 암호화하는 유전자로 식별했습니다.
본 연구에서는 개별 근섬유의 대규모 단백질체 특성 분석을 위한 포괄적인 워크플로우를 개발하고, 건강한 상태에서 근섬유 이질성을 조절하는 인자를 규명했습니다. 이 워크플로우를 적용하여 네말린 근병증이 골격근 섬유 이질성에 미치는 영향을 이해하고자 했습니다. 네말린 근병증은 유전성 근육 질환으로 근력 약화를 유발하며, 환아에서는 호흡곤란, 척추측만증, 사지 운동 제한 등 다양한 합병증을 동반합니다.^19,20 일반적으로 네말린 근병증에서는 액틴 알파 1(ACTA1)과 같은 유전자의 병원성 변이로 인해 지근섬유가 우세하게 나타나지만, 이러한 효과는 질환에 따라 다릅니다. 특히 트로포닌 T1 네말린 근병증(TNNT1)은 속근섬유가 우세한 특징을 보이는 예외적인 경우입니다. 따라서 네말린 근병증에서 관찰되는 골격근 섬유 기능 이상을 유발하는 이질성을 더 잘 이해하면 이러한 질환과 근섬유 유형 간의 복잡한 관계를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.
건강한 대조군(그룹당 n=3)과 비교했을 때, ACTA1 및 TNNT1 유전자 변이가 있는 네말린 근병증 환자에서 분리한 근섬유는 현저한 근섬유 위축 또는 이영양증을 보였다(그림 6A, 보충표 3). 이는 제한된 시료량으로 인해 단백질체 분석에 상당한 기술적 어려움을 초래했다. 그럼에도 불구하고, 우리는 272개의 골격근 근섬유에서 2485개의 단백질을 검출할 수 있었다. 근섬유당 최소 1000개의 정량화된 단백질을 기준으로 필터링한 후, 250개의 근섬유를 대상으로 생물정보학 분석을 수행했다. 필터링 후, 근섬유당 평균 1573 ± 359개의 단백질이 정량화되었다(보충 그림 10A, 보충 데이터 세트 17-18). 주목할 만한 점은 근섬유 크기가 현저히 감소했음에도 불구하고, 네말린 근병증 환자 시료의 단백질체 분석 깊이는 비교적 적게 감소했다는 것이다. 또한, 자체 FASTA 파일(비코딩 전사체 포함)을 사용하여 이러한 데이터를 처리한 결과, 네말린 근병증 환자의 골격근 섬유에서 5개의 미생물 단백질을 식별할 수 있었습니다(보충 데이터 세트 19). 프로테옴의 동적 범위는 상당히 넓었으며, 대조군의 총 단백질량은 이전의 1000개 섬유 프로테옴 분석 결과와 높은 상관관계를 보였습니다(보충 그림 10B–C).
A. ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증(NM)에서 MYH에 따른 섬유 위축 또는 이영양증 및 다양한 섬유 유형의 우세도를 보여주는 현미경 이미지. 스케일 바 = 100 μm. ACTA1 및 TNNT1 환자에서 염색의 재현성을 확보하기 위해, 대표 이미지를 선택하기 전에 환자 생검 샘플 3개를 2~3회 염색했습니다(환자당 4개의 절편). B. MYH에 따른 참가자의 섬유 유형 비율. C. 네말린 근병증 환자와 대조군의 골격근 섬유에 대한 주성분 분석(PCA) 플롯. D. 그림 2에서 분석한 1000개의 섬유를 기반으로 결정된 PCA 플롯에 투영된 네말린 근병증 환자와 대조군의 골격근 섬유. 예를 들어, ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증 참가자와 대조군 간의 차이, 그리고 ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증 참가자 간의 차이를 비교하는 화산 플롯. 색깔 있는 원은 π < 0.05에서 유의미한 차이를 보인 단백질을 나타내고, 어두운 점은 FDR < 0.05에서 유의미한 차이를 보인 단백질을 나타냅니다. 통계 분석은 Limma 선형 모델 방법과 경험적 베이지안 방법을 사용하여 수행되었으며, 다중 비교에 대한 p값 조정은 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 수행되었습니다. H. 전체 프로테옴 및 1형과 2A형 섬유에서 유의미하게 차등 발현된 단백질에 대한 농축 분석. 통계 분석은 clusterProfiler 패키지를 사용하여 수행되었으며, Benjamini-Hochberg로 조정된 p값을 사용했습니다. I, J. 세포외 기질 및 미토콘드리아 유전자 온톨로지(GO) 용어에 따라 색칠된 주성분 분석(PCA) 플롯.
네말린 근병증은 골격근에서 MYH 발현 근섬유 유형의 비율에 영향을 미칠 수 있기 때문에,^19,20 먼저 네말린 근병증 환자와 대조군에서 MYH 발현 근섬유 유형을 조사했습니다. 근섬유 유형은 이전에 1000개 근섬유 분석에 대해 설명된 편향되지 않은 방법을 사용하여 결정했으며(보충 그림 10D-E), 순수한 2X 근섬유는 다시 확인되지 않았습니다(그림 6B). 네말린 근병증이 근섬유 유형에 미치는 영향은 이질적인 것으로 나타났는데, ACTA1 돌연변이가 있는 두 환자에서는 1형 근섬유 비율이 증가한 반면, TNNT1 네말린 근병증이 있는 두 환자에서는 1형 근섬유 비율이 감소했습니다(그림 6B). 실제로 ACTA1-네말린 근병증에서는 MYH2 및 속효성 트로포닌 동형 단백질(TNNC2, TNNI2 및 TNNT3)의 발현이 감소한 반면, TNNT1-네말린 근병증에서는 MYH7의 발현이 감소했습니다(보충 그림 11A). 이는 네말린 근병증에서 나타나는 이질적인 근섬유 유형 전환에 대한 이전 보고와 일치합니다.19,20 우리는 면역조직화학을 통해 이러한 결과를 확인했으며, ACTA1-네말린 근병증 환자에서는 제1형 근섬유가 우세한 반면, TNNT1-네말린 근병증 환자에서는 반대 양상을 보였습니다(그림 6A).
단일 섬유 단백질체 수준에서 ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증 환자의 골격근 섬유는 대부분의 대조군 섬유와 함께 군집을 이루었으며, TNNT1 네말린 근병증 섬유가 일반적으로 가장 심하게 영향을 받은 것으로 나타났습니다(그림 6C). 이는 각 환자의 가상 팽창 섬유에 대한 주성분 분석(PCA) 플롯을 작성했을 때 특히 분명하게 나타났으며, TNNT1 네말린 근병증 환자 2와 3이 대조군 샘플과 가장 멀리 떨어져 있는 것으로 나타났습니다(보충 그림 11B, 보충 데이터 세트 20). 근병증 환자의 섬유가 건강한 섬유와 어떻게 비교되는지 더 잘 이해하기 위해, 건강한 성인 참가자 1,000명의 섬유에 대한 단백질체 분석에서 얻은 상세 정보를 사용했습니다. 근병증 데이터 세트(ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증 환자와 대조군)의 섬유를 1,000개 섬유 단백질체 분석에서 얻은 PCA 플롯에 투영했습니다(그림 6D). 대조군 근섬유에서 PC2를 따라 분포하는 MYH 섬유 유형은 1000개 섬유 단백질체 분석에서 얻은 섬유 분포와 유사했습니다. 그러나 네말린 근병증 환자의 대부분의 섬유는 MYH 섬유 유형과 관계없이 PC2 아래쪽으로 이동하여 건강한 속근 섬유와 겹쳤습니다. 따라서 ACTA1 네말린 근병증 환자는 MYH 기반 방법을 사용하여 정량화했을 때 1형 섬유 쪽으로 이동하는 경향을 보였지만, ACTA1 네말린 근병증과 TNNT1 네말린 근병증 모두 골격근 섬유 단백질체가 속근 섬유 쪽으로 이동하는 양상을 보였습니다.
우리는 각 환자 그룹을 건강한 대조군과 직접 비교하여 ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증에서 각각 256개와 552개의 차등 발현 단백질을 확인했습니다(그림 6E–G 및 보충 그림 11C, 보충 데이터 세트 21). 유전자 풍부도 분석 결과, 미토콘드리아 단백질의 동시적인 감소가 나타났습니다(그림 6H–I, 보충 데이터 세트 22). 놀랍게도, ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증에서 섬유 유형의 우세도가 다름에도 불구하고, 이러한 감소는 MYH 기반 섬유 유형과는 완전히 무관했습니다(그림 6H 및 보충 그림 11D–I, 보충 데이터 세트 23). 또한 세 가지 미생물 단백질이 ACTA1 또는 TNNT1 네말린 근병증에서 조절되었습니다. 이들 미세단백질 중 ENSG00000215483_TR14_ORF67(LINC00598 또는 Lnc-FOXO1로도 알려짐)과 ENSG00000229425_TR25_ORF40(lnc-NRIP1-2) 두 가지는 1형 근섬유에서만 차등적인 풍부도를 보였다. ENSG00000215483_TR14_ORF67은 이전에 세포 주기 조절에 관여하는 것으로 보고되었다.56 반면, ENSG00000232046_TR1_ORF437(LINC01798에 해당)은 건강한 대조군과 비교했을 때 ACTA1-네말린 근병증에서 1형 및 2A형 근섬유 모두에서 증가했다(보충 그림 12A, 보충 데이터 세트 24). 대조적으로, 리보솜 단백질은 네말린 근병증의 영향을 거의 받지 않았지만, RPS17은 ACTA1 네말린 근병증에서 하향 조절되었습니다(그림 6E).
농축 분석 결과, ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증에서 면역 체계 과정의 상향 조절이 확인되었으며, TNNT1 네말린 근병증에서는 세포 접착도 증가했습니다(그림 6H). 이러한 세포외 인자의 농축은 세포외 기질 단백질이 PC1 및 PC2의 PCA를 음의 방향(즉, 가장 영향을 많이 받은 근섬유 쪽)으로 이동시키는 것으로 나타났습니다(그림 6J). 두 환자군 모두에서 면역 반응 및 근형질막 복구 기전에 관여하는 세포외 단백질, 예를 들어 안넥신(ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 및 이들과 상호작용하는 단백질 S100A1159의 발현이 증가했습니다(보충 그림 12B-C). 이러한 과정은 이전에 근디스트로피60에서 강화되는 것으로 보고되었지만, 저희가 아는 한 네말린 근병증과 관련된 것으로는 이전에 보고된 바 없습니다. 이 분자 기계의 정상적인 기능은 손상 후 근막 복구와 새로 형성된 근세포와 근섬유의 융합에 필요합니다.58,61 따라서 두 환자 그룹 모두에서 이 과정의 활성이 증가한 것은 근섬유 불안정성으로 인한 손상에 대한 복구 반응을 시사합니다.
각 네말린 근병증의 효과는 높은 상관관계(r = 0.736)를 보였고, 상당한 중복성을 나타냈습니다(보충 그림 11A-B). 이는 ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증이 단백질체에 유사한 영향을 미친다는 것을 의미합니다. 그러나 일부 단백질은 ACTA1 또는 TNNT1 네말린 근병증에서만 조절되었습니다(보충 그림 11A 및 C). 섬유화 촉진 단백질인 MFAP4는 TNNT1 네말린 근병증에서 가장 많이 상향 조절된 단백질 중 하나였지만, ACTA1 네말린 근병증에서는 변화가 없었습니다. HOX 유전자 전사 조절에 관여하는 PAF1C 복합체의 구성 요소인 SKIC8은 TNNT1 네말린 근병증에서 하향 조절되었지만, ACTA1 네말린 근병증에서는 영향을 받지 않았습니다(보충 그림 11A). ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증을 직접 비교한 ​​결과, TNNT1 네말린 근병증에서 미토콘드리아 단백질의 감소가 더 크고 면역계 단백질의 증가가 더 크게 나타났습니다(그림 6G–H 및 보충 그림 11C 및 11H–I). 이러한 데이터는 TNNT1 네말린 근병증에서 관찰된 TNNT1 네말린 근병증에 비해 더 심한 위축/근이영양증이 나타나는 것과 일치하며(그림 6A), TNNT1 네말린 근병증이 더 심각한 형태의 질병임을 시사합니다.
네말린 근병증의 관찰된 효과가 근육 전체 수준에서 지속되는지 평가하기 위해, 동일한 TNNT1 네말린 근병증 환자 코호트에서 채취한 근육 생검 조직에 대한 대량 단백질체 분석을 수행하고 대조군(그룹당 n=3)과 비교했습니다(보충 그림 13A, 보충 데이터 세트 25). 예상대로, 주성분 분석에서 대조군은 환자군과 밀접한 관련성을 보인 반면, TNNT1 네말린 근병증 환자군은 단일 섬유 분석에서 나타난 것과 유사하게 높은 샘플 간 변동성을 보였습니다(보충 그림 13B). 대량 분석은 개별 섬유 비교에서 강조된 차등 발현 단백질(보충 그림 13C, 보충 데이터 세트 26)과 생물학적 과정(보충 그림 13D, 보충 데이터 세트 27)을 재현했지만, 서로 다른 섬유 유형을 구별하는 능력은 상실했고 섬유 전체에 걸쳐 나타나는 이질적인 질병 효과를 설명하지 못했습니다.
이러한 데이터들을 종합해 보면, 단일 근섬유 단백질체학은 면역블롯팅과 같은 표적 분석법으로는 검출할 수 없는 임상적 생물학적 특징을 밝혀낼 수 있음을 보여줍니다. 더욱이, 이러한 데이터는 표현형 적응을 설명하는 데 액틴 섬유 유형(MYH)만을 사용하는 것의 한계를 강조합니다. 실제로, 액틴 네말린 근병증과 트로포닌 네말린 근병증은 섬유 유형 전환 양상이 다르지만, 두 네말린 근병증 모두 MYH 섬유 유형 분류를 골격근 섬유 대사로부터 분리시켜 더 빠르고 산화성이 낮은 근육 단백질체를 나타냅니다.
세포 이질성은 조직이 다양한 요구를 충족하는 데 필수적입니다. 골격근에서 이는 종종 서로 다른 정도의 힘 생성 능력과 피로도를 특징으로 하는 섬유 유형으로 설명됩니다. 그러나 이는 골격근 섬유 변이의 극히 일부분만을 설명할 뿐이며, 실제 골격근 섬유 변이는 이전에 생각했던 것보다 훨씬 더 다양하고 복잡하며 다면적입니다. 기술 발전으로 골격근 섬유를 조절하는 요인에 대한 이해가 깊어졌습니다. 실제로, 우리의 데이터는 2X형 섬유가 별개의 골격근 섬유 아형이 아닐 수 있음을 시사합니다. 더욱이, 우리는 대사 단백질, 리보솜 단백질 및 세포 관련 단백질이 골격근 섬유 이질성의 주요 결정인자임을 확인했습니다. 선충 근병증 환자 샘플에 우리의 단백질체학 워크플로우를 적용하여, 특히 시스템에 교란이 가해졌을 때 MYH 기반 섬유 유형 분류가 골격근 이질성을 완전히 반영하지 못한다는 것을 추가로 입증했습니다. 실제로 MYH 기반 섬유 유형과 관계없이 선충 근병증은 더 빠르고 산화성이 낮은 섬유 쪽으로의 변화를 초래합니다.
골격근 섬유는 19세기부터 분류되어 왔습니다. 최근의 오믹스 분석을 통해 다양한 MYH 섬유 유형의 발현 양상과 다양한 자극에 대한 반응을 이해하기 시작했습니다. 본 연구에서 설명하는 바와 같이, 오믹스 접근법은 기존의 항체 기반 방법보다 섬유 유형 마커를 정량화하는 데 더 높은 민감도를 제공하며, 골격근 섬유 유형을 정의하기 위해 단일(또는 소수의) 마커 정량화에 의존하지 않는다는 장점이 있습니다. 우리는 상호 보완적인 전사체 및 단백체 워크플로우를 사용하고 결과를 통합하여 인간 골격근 섬유의 이질성에 대한 전사 및 전사 후 조절을 조사했습니다. 이 워크플로우를 통해 건강한 젊은 남성 코호트의 대퇴외측근에서 단백질 수준에서 순수한 2X형 섬유를 식별하는 데 실패했습니다. 이는 건강한 대퇴외측근에서 순수한 2X형 섬유가 1% 미만이라는 이전의 단일 섬유 연구 결과와 일치하지만, 향후 다른 근육에서도 확인이 필요합니다. mRNA 수준에서는 거의 순수한 2X 섬유가 검출되었지만 단백질 수준에서는 2A/2X 혼합 섬유만 검출된 것은 의아한 점입니다. MYH 동형 mRNA 발현은 일주기성을 나타내지 않으므로, RNA 수준에서 겉보기에 순수한 2X 섬유에서 MYH2 발현 신호를 "놓쳤을" 가능성은 낮습니다. 순전히 가설에 불과하지만, 한 가지 가능한 설명은 MYH 동형 단백질 간의 단백질 및/또는 mRNA 안정성 차이일 수 있습니다. 실제로 어떤 속근 섬유도 특정 MYH 동형 단백질에 대해 100% 순수하지 않으며, MYH1 mRNA 발현 수준이 70~90% 범위일 때 단백질 수준에서 MYH1과 MYH2의 발현량이 동일할지는 불분명합니다. 그러나 전체 전사체 또는 단백질체를 고려할 때, 클러스터 분석은 정확한 MYH 구성과 관계없이 느린 골격근 섬유와 빠른 골격근 섬유를 나타내는 두 개의 뚜렷한 클러스터만을 확실하게 식별할 수 있습니다. 이는 일반적으로 두 개의 서로 다른 근핵 클러스터만 식별하는 단일 핵 전사체 분석 접근법을 사용한 분석 결과와 일치합니다. 68, 69, 70 또한, 이전 단백질체 연구에서 2X형 섬유가 확인되었지만, 이 섬유는 나머지 속근 섬유와 별도로 클러스터링되지 않으며 MYH를 기준으로 다른 섬유 유형과 비교했을 때 차등적으로 풍부한 단백질의 수가 적습니다. 14 이러한 결과는 MYH를 기준으로 인간 골격근 섬유를 세 가지 유형으로 나누는 것이 아니라 대사 및 수축 특성을 기준으로 두 가지 클러스터로 나누었던 20세기 초반의 근섬유 분류 관점으로 돌아가야 함을 시사합니다. 63
더욱 중요한 것은 근섬유 이질성을 다차원적으로 고려해야 한다는 점입니다. 이전의 "오믹스" 연구들은 골격근 섬유가 개별적인 군집을 형성하는 것이 아니라 연속체로 배열되어 있음을 시사하며 이러한 방향을 제시해 왔습니다. 11, 13, 14, 64, 71 본 연구에서는 골격근의 수축 및 대사 특성 차이 외에도 세포 간 상호작용 및 번역 메커니즘과 관련된 특징으로 근섬유를 구분할 수 있음을 보여줍니다. 실제로, 우리는 골격근 섬유에서 리보솜 이질성을 발견했으며, 이는 느린 섬유와 빠른 섬유 유형과는 무관하게 이질성에 기여합니다. 느린 근섬유와 빠른 근섬유 유형과 무관하게 나타나는 이러한 상당한 근섬유 이질성의 근본적인 원인은 아직 불분명하지만, 특정 힘과 부하에 최적으로 반응하는 근섬유 다발 내의 특수화된 공간적 구조72, 근육 미세환경 내 다른 세포 유형과의 특수화된 세포 또는 기관 특이적 소통73,74,75, 또는 개별 근섬유 내 리보솜 활성의 차이와 관련이 있을 수 있습니다. 실제로, RPL3 및 RPL3L의 상동 유전자 치환 또는 rRNA의 2'O-메틸화 수준을 통한 리보솜 이형성은 골격근 비대와 관련이 있는 것으로 나타났습니다76,77. 다중 오믹스 및 공간적 응용과 개별 근섬유의 기능적 특성화를 결합하면 다중 오믹스 수준에서 근육 생물학에 대한 이해를 더욱 발전시킬 수 있을 것입니다78.
네말린 근병증 환자의 단일 근섬유 단백질체를 분석함으로써, 우리는 골격근의 임상 병태생리를 규명하는 데 있어 단일 근섬유 단백질체학의 유용성, 효율성 및 적용 가능성을 입증했습니다. 더욱이, 우리의 워크플로우를 전체 조직 단백질체 분석과 비교함으로써, 단일 근섬유 단백질체학이 전체 조직 단백질체학만큼 심도 있는 정보를 제공하며, 근섬유 간 이질성과 근섬유 유형을 고려하여 그 심도를 확장한다는 것을 보여주었습니다. 건강한 대조군과 비교하여 ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증에서 관찰되는 예상되는 (비록 가변적이기는 하지만) 근섬유 유형 비율의 차이 외에도, 우리는 MYH 매개 근섬유 유형 전환과는 무관한 산화적 및 세포외 재형성을 관찰했습니다. TNNT1 네말린 근병증에서 섬유증이 이전에 보고된 바 있다.19 그러나 본 연구에서는 ACTA1 및 TNNT1 네말린 근병증 환자의 근섬유에서 세포막 복구 기전에 관여하는 안넥신과 같은 세포외 분비 스트레스 관련 단백질의 수치가 증가했음을 밝혀냈다.57,58,59 결론적으로, 네말린 근병증 환자의 근섬유에서 증가된 안넥신 수치는 심하게 위축된 근섬유를 복구하려는 세포 반응을 나타내는 것일 수 있다.
본 연구는 현재까지 수행된 인간 대상 단일 근섬유 전체 근육 오믹스 분석 중 가장 규모가 큰 연구이지만, 몇 가지 한계점도 있습니다. 우리는 비교적 적은 수의 동질적인 참가자 표본과 단일 근육(대퇴외측근)에서 골격근 섬유를 분리했습니다. 따라서 근육 유형별, 그리고 근육 생리학적 극단적인 조건에서 특정 섬유 집단이 존재할 가능성을 완전히 배제할 수는 없습니다. 예를 들어, 고도로 훈련된 단거리 선수나 근력 운동 선수79 또는 근육 활동이 없는 기간66,80 동안 초속근 섬유(예: 순수 2X 섬유)의 하위 집단이 나타날 가능성을 배제할 수 없습니다. 또한, 제한된 참가자 표본 크기로 인해 남녀 간 섬유 유형 비율의 차이를 조사할 수 없었습니다. 더욱이, 동일한 근섬유 또는 동일한 참가자의 샘플에 대해 전사체 및 단백체 분석을 동시에 수행할 수 없었습니다. 저희를 비롯한 여러 연구진이 오믹스 분석을 활용하여 단일 세포 및 단일 근섬유 분석을 최적화하고, (미토콘드리아 근병증 환자의 근섬유 분석에서 보여준 것처럼) 극히 적은 양의 시료로 분석을 수행하는 가운데, 단일 근섬유 내에서 다중 오믹스(및 기능적) 접근법을 결합할 수 있는 가능성이 분명해지고 있습니다.
종합적으로, 본 연구 데이터는 골격근 이질성의 전사적 및 전사 후 조절 요인을 규명하고 설명합니다. 특히, 우리는 고전적인 MYH 기반 근섬유 유형 정의와 관련된 골격근 생리학의 오랜 통념에 도전하는 데이터를 제시합니다. 본 연구를 통해 골격근 섬유 분류 및 이질성에 대한 논의를 재개하고 궁극적으로 그 이해를 재고하고자 합니다.
백인 참가자 14명(남성 12명, 여성 2명)이 본 연구에 자발적으로 참여하기로 동의했습니다. 본 연구는 겐트대학교병원 윤리위원회(BC-10237)의 승인을 받았으며, 2013년 헬싱키 선언을 준수하고 ClinicalTrials.gov(NCT05131555)에 등록되었습니다. 참가자의 일반적인 특성은 부록 표 1에 제시되어 있습니다. 구두 및 서면 동의를 받은 후, 참가자들은 연구 최종 참여 전에 건강 검진을 받았습니다. 참가자는 젊고(22~42세), 건강하며(기저질환 없음, 흡연 경력 없음), 적당한 수준의 신체 활동을 하는 사람들이었습니다. 최대 산소 섭취량은 이전에 설명된 바와 같이 스텝 에르고미터를 사용하여 측정했습니다.81
근육 생검 샘플은 휴식 상태와 공복 상태에서 14일 간격으로 세 번 채취했습니다. 이 샘플들은 더 큰 규모의 연구의 일환으로 수집되었기 때문에, 참가자들은 생검 40분 전에 위약(유당), H1 수용체 길항제(펙소페나딘 540mg), 또는 H2 수용체 길항제(파모티딘 40mg)를 섭취했습니다. 우리는 이전에 이러한 히스타민 수용체 길항제가 휴식 상태의 골격근 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증했으며81, 품질 관리 도표에서도 상태 관련 군집화는 관찰되지 않았습니다(보충 그림 3 및 6). 각 실험일 48시간 전부터 표준화된 식단(체중 1kg당 41.4kcal, 탄수화물 5.1g/kg, 단백질 1.4g/kg, 지방 1.6g/kg)을 유지했으며, 실험일 아침에는 표준화된 아침 식사(탄수화물 1.5g/kg)를 섭취했습니다. 국소 마취(에피네프린이 없는 1% 리도카인 0.5ml) 하에 경피적 Bergström 흡인법을 사용하여 대퇴외측근에서 근육 생검을 채취했습니다.82 근육 샘플은 즉시 RNAlater에 넣어 수동 섬유 해부(최대 3일) 전까지 4°C에서 보관했습니다.
새로 분리한 근섬유 다발을 배양 접시에 담긴 새로운 RNAlater 배지로 옮겼습니다. 그런 다음 입체현미경과 미세 핀셋을 사용하여 개별 근섬유를 수동으로 분리했습니다. 각 생검 조직에서 25개의 섬유를 분리했으며, 생검 조직의 서로 다른 부위에서 섬유를 선택하도록 특별히 주의했습니다. 분리 후, 각 섬유를 단백질 분해효소 K와 DNase 효소가 포함된 용해 완충액(SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) 3μl에 조심스럽게 담가 불필요한 단백질과 DNA를 제거했습니다. 세포 용해 및 단백질/DNA 제거는 짧은 시간 동안 볼텍싱하고, 마이크로 원심분리기로 액체를 원심분리한 후, 실온에서 10분 동안 배양하여 시작했습니다. 용해액을 열 순환기(T100, Bio-Rad)에서 37°C에서 5분, 75°C에서 5분 동안 배양한 후, 추가 처리를 위해 즉시 -80°C에서 보관했습니다.
Illumina 호환 폴리아데닐화 RNA 라이브러리는 QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit(Lexogen)를 사용하여 2 µl의 근섬유 용해액으로부터 제작되었습니다. 자세한 방법은 제조사 설명서를 참조하십시오. 이 과정은 역전사를 통한 1차 가닥 cDNA 합성으로 시작되며, 이 과정에서 고유 분자 식별자(UMI)와 샘플별 i1 바코드가 도입되어 샘플 풀링을 보장하고 후속 처리 과정에서 기술적 변동성을 줄입니다. 96개의 근섬유에서 추출한 cDNA를 풀링하고 자성 비드를 이용하여 정제한 후, RNA를 제거하고 무작위 프라이머를 사용하여 2차 가닥 합성을 수행합니다. 라이브러리를 자성 비드를 이용하여 정제하고, 풀별 i5/i7 태그를 첨가한 후 PCR 증폭을 진행합니다. 최종 정제 단계를 통해 Illumina 호환 라이브러리를 얻습니다. 각 라이브러리 풀의 품질은 High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit(Agilent Technologies, DNF-477-0500)를 사용하여 평가했습니다.
Qubit 정량 분석을 기반으로, 각 풀을 동일 몰 농도(2 nM)로 다시 혼합했습니다. 이렇게 얻은 풀을 NovaSeq 6000 기기에서 표준 모드로, NovaSeq S2 시약 키트(1 × 100 뉴클레오티드)와 2 nM 로딩(4% PhiX)을 사용하여 시퀀싱했습니다.
본 연구의 파이프라인은 Lexogen의 QuantSeq Pool 데이터 분석 파이프라인(https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis)을 기반으로 합니다. 먼저 i7/i5 인덱스를 사용하여 bcl2fastq2(v2.20.0)로 데이터를 디멀티플렉싱했습니다. 그 후, i1 샘플 바코드를 기반으로 idemux(v0.1.6)를 사용하여 리드 2를 디멀티플렉싱하고, umi_tools(v1.0.1)로 UMI 서열을 추출했습니다. 이어서 cutadapt(v3.4)를 여러 차례 사용하여 짧은 리드(길이 20 미만) 또는 어댑터 서열만으로 구성된 리드를 제거했습니다. 마지막으로 STAR(v2.6.0c)를 사용하여 리드를 인간 게놈에 정렬하고, SAMtools(v1.11)로 BAM 파일을 인덱싱했습니다. 마지막으로 umi_tools(v1.0.1)를 사용하여 중복 리드를 제거했습니다. 마지막으로, Subread(v2.0.3)의 featureCounts를 사용하여 정렬 카운팅을 수행했습니다. 품질 관리는 파이프라인의 여러 중간 단계에서 FastQC(v0.11.9)를 사용하여 수행했습니다.
모든 추가적인 생물정보학 처리 및 시각화는 주로 Seurat(v4.4.0) 워크플로우를 사용하여 R(v4.2.3)에서 수행되었습니다.83 따라서 개별 UMI 값과 메타데이터 행렬은 Seurat 객체로 변환되었습니다. 전체 섬유의 30% 미만에서 발현된 유전자는 제거되었습니다. 최소 1000개의 UMI 값과 1000개의 검출된 유전자를 기준으로 품질이 낮은 샘플이 제거되었습니다. 최종적으로 925개의 섬유가 모든 품질 관리 필터링 단계를 통과했습니다. UMI 값은 검출된 7418개의 모든 특징을 포함하여 Seurat SCTransform v2 방법을 사용하여 정규화되었으며, 참가자 간 차이는 회귀 분석을 통해 제거되었습니다. 모든 관련 메타데이터는 보충 데이터 세트 28에서 확인할 수 있습니다.