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Modic Change(MC)의 동물 모델 확립은 MC 연구를 위한 중요한 기초입니다. 54마리의 뉴질랜드 흰토끼를 가짜수술군, 근육 이식군(ME군), 속질핵 이식군(NPE군)으로 나누었다. NPE 그룹에서는 전외측 요추 수술로 추간판을 노출시키고 바늘을 사용하여 종판 근처의 L5 척추체를 천자했습니다. 주사기로 L1/2 추간판에서 NP를 추출하여 주입했습니다. 연골하 뼈에 구멍을 뚫습니다. 근육 이식군과 가짜 수술군의 수술 절차 및 드릴링 방법은 NP 이식군과 동일했습니다. ME 그룹에서는 근육 조각을 구멍에 넣은 반면, 가짜 수술 그룹에서는 아무것도 구멍에 넣지 않았습니다. 수술 후 MRI 스캔과 분자생물학적 검사를 실시했습니다. NPE 그룹에서는 신호가 바뀌었지만, sham-Operation 그룹과 ME 그룹에서는 뚜렷한 신호 변화가 없었습니다. 조직학적 관찰에 따르면 이식 부위에서 비정상적인 조직 증식이 관찰되었으며 NPE 그룹에서 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 발현이 증가했습니다. 연골하골에 NP를 이식하면 MC의 동물 모델이 형성될 수 있습니다.
Modic Change(MC)는 자기공명영상(MRI)에서 볼 수 있는 척추 종판과 인접한 골수의 병변입니다. 이는 관련 증상이 있는 개인에게 매우 흔합니다1. 많은 연구에서 MC가 요통(LBP)과 연관되어 있기 때문에 MC의 중요성이 강조되었습니다2,3. de Roos et al.4와 Modic et al.5는 독립적으로 처음으로 척추 골수에서 세 가지 다른 유형의 연골하 신호 이상을 기술했습니다. Modic 유형 I 변화는 T1 가중(T1W) 시퀀스에서 저신호 강도이고 T2 가중(T2W) 시퀀스에서 고강도입니다. 이 병변은 골수 내 열구 종판과 인접한 혈관 육아 조직을 드러냅니다. Modic 유형 II 변경 사항은 T1W 및 T2W 시퀀스 모두에서 높은 신호를 나타냅니다. 이러한 유형의 병변에서는 말단판 파괴와 인접한 골수의 조직학적 지방 대체가 발견될 수 있습니다. Modic 유형 III 변경 사항은 T1W 및 T2W 시퀀스에서 낮은 신호를 나타냅니다. 종판에 해당하는 경화성 병변이 관찰되었습니다6. MC는 척추의 병리학적 질환으로 간주되며 척추의 많은 퇴행성 질환과 밀접하게 연관되어 있습니다7,8,9.
이용 가능한 데이터를 고려하여 여러 연구에서 MC의 병인 및 병리학적 메커니즘에 대한 자세한 통찰력을 제공했습니다. Albertet al. MC는 추간판 탈출로 인해 발생할 수 있다고 제안했습니다8. Huet al. MC는 심각한 디스크 변성으로 인해 발생합니다10. 크록(Kroc)은 반복적인 디스크 외상으로 인해 종판의 미세 파열이 발생할 수 있다는 "내부 디스크 파열"이라는 개념을 제안했습니다. 갈라진 틈이 형성된 후, 속질핵(NP)에 의한 종판 파괴는 자가면역 반응을 유발할 수 있으며, 이는 MC11의 발달로 이어집니다. Maet al. 유사한 견해를 공유하고 NP 유발 자가면역이 MC12 발병에 중요한 역할을 한다고 보고했습니다.
면역체계 세포, 특히 CD4+ T 보조 림프구는 자가면역 발병에 중요한 역할을 합니다13. 최근 발견된 Th17 하위 집합은 전염증성 사이토카인 IL-17을 생성하고, 케모카인 발현을 촉진하며, 손상된 기관의 T 세포가 IFN-γ14를 생성하도록 자극합니다. Th2 세포는 또한 면역 반응의 발병에서 독특한 역할을 합니다. 대표적인 Th2 세포인 IL-4의 발현은 심각한 면역병리학적 결과를 초래할 수 있습니다15.
MC16,17,18,19,20,21,22,23,24에 대해 많은 임상 연구가 수행되었지만 인간에서 자주 발생하는 MC 과정을 모방할 수 있고 이를 모방할 수 있는 적합한 동물 실험 모델이 여전히 부족합니다. 병인을 조사하거나 표적치료와 같은 새로운 치료법을 조사하는 데 사용됩니다. 현재까지 MC의 몇 가지 동물 모델만이 근본적인 병리학적 메커니즘을 연구하는 것으로 보고되었습니다.
Albert와 Ma가 제안한 자가면역 이론을 바탕으로 이 연구에서는 천공된 척추 말단판 근처에 NP를 자가 이식하여 간단하고 재현 가능한 토끼 MC 모델을 확립했습니다. 다른 목적은 동물 모델의 조직학적 특성을 관찰하고 MC 발달에서 NP의 특정 메커니즘을 평가하는 것입니다. 이를 위해 우리는 분자 생물학, MRI 및 조직학 연구와 같은 기술을 사용하여 MC의 진행을 연구합니다.
토끼 2마리는 수술 중 출혈로 사망했고, 토끼 4마리는 MRI 촬영 중 마취 도중 사망했다. 나머지 48마리의 토끼는 살아남았으며 수술 후에도 행동이나 신경학적 징후가 나타나지 않았습니다.
MRI는 서로 다른 구멍에 내장된 조직의 신호 강도가 다르다는 것을 보여줍니다. NPE 그룹의 L5 척추체의 신호 강도는 삽입 후 12주, 16주, 20주에 점차적으로 변화했습니다(T1W 순서는 낮은 신호를 보였으며 T2W 순서는 혼합 신호와 낮은 신호를 나타냄)(그림 1C). 다른 두 그룹의 내장 부품은 같은 기간 동안 비교적 안정적으로 유지되었습니다(그림 1A, B).
(A) 3개 시점에서 토끼 요추의 대표적인 순차 MRI. 가짜 수술 그룹의 이미지에서는 신호 이상이 발견되지 않았습니다. (B) ME 그룹의 척추체의 신호 특성은 가짜 수술 그룹의 신호 특성과 유사하며 시간이 지남에 따라 임베딩 사이트에서 중요한 신호 변화가 관찰되지 않습니다. (C) NPE 그룹에서는 T1W 시퀀스에서 낮은 신호가 뚜렷하게 보이고, T2W 시퀀스에서는 혼합 신호와 낮은 신호가 뚜렷하게 보입니다. 12주부터 20주까지 T2W 시퀀스에서 낮은 신호 주변의 산발적인 높은 신호가 감소합니다.
NPE 군에서는 척추체 이식 부위에서 뚜렷한 골 증식이 관찰되며, NPE 군에 비해 골 증식은 12주에서 20주 사이에 더 빠르게 발생하며(그림 2C), 모델링된 척추에서는 큰 변화가 관찰되지 않습니다. 시체; 가짜 그룹 및 ME 그룹(그림 2C) 2A,B).
(A) 이식된 부분의 척추체 표면은 매우 매끄러우며, 구멍이 잘 치유되고, 척추체에 증식이 없습니다. (B) ME 그룹의 이식 부위의 모양은 가짜 수술 그룹의 모양과 유사하며, 시간이 지나도 이식 부위의 외관에는 뚜렷한 변화가 없습니다. (C) NPE군에서는 이식 부위에 골증식이 발생하였다. 뼈 증식은 빠르게 증가했으며 심지어 추간판을 통해 반대쪽 척추체까지 확장되었습니다.
조직학적 분석은 뼈 형성에 대한 보다 자세한 정보를 제공합니다. 그림 3은 H&E로 염색된 수술 후 단면의 사진을 보여줍니다. 가짜 수술 그룹에서는 연골 세포가 잘 배열되어 있으며 세포 증식이 감지되지 않았습니다 (그림 3A). ME 그룹의 상황은 가짜 수술 그룹의 상황과 유사했습니다(그림 3B). 그러나 NPE 그룹에서는 이식 부위에서 많은 수의 연골 세포와 NP 유사 세포의 증식이 관찰되었습니다 (그림 3C).
(A) 끝판 근처에서 섬유주를 볼 수 있으며, 연골세포는 균일한 세포 크기와 모양으로 깔끔하게 배열되어 있으며 증식이 없습니다(40배). (B) ME 그룹의 이식 부위 상태는 가짜 그룹의 상태와 유사합니다. 섬유주와 연골세포를 볼 수 있으나 이식 부위(40회)에서는 뚜렷한 증식이 없습니다. (B) 연골세포와 NP 유사세포가 크게 증식하고, 연골세포의 모양과 크기가 고르지 않음(40배)을 확인할 수 있다.
NPE군과 ME군 모두에서 인터루킨 4(IL-4) mRNA, 인터루킨 17(IL-17) mRNA, 인터페론 γ(IFN-γ) mRNA의 발현이 관찰되었다. 표적 유전자의 발현 수준을 비교한 결과, ME군 및 가짜 수술군에 비해 NPE군에서 IL-4, IL-17, IFN-γ의 유전자 발현이 유의하게 증가하였다(도 4). (P < 0.05). 가짜 수술 그룹과 비교하여 ME 그룹의 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 발현 수준은 약간만 증가했으며 통계적 변화에 도달하지 못했습니다(P > 0.05).
NPE군에서 IL-4, IL-17, IFN-γ의 mRNA 발현은 sham 수술군과 ME군에 비해 유의하게 높은 경향을 보였다(P < 0.05).
반면, ME 그룹의 발현 수준은 유의한 차이를 보이지 않았다(P>0.05).
변경된 mRNA 발현 패턴을 확인하기 위해 IL-4 및 IL-17에 대해 시판되는 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. 그림 5A,B에서 볼 수 있듯이 ME 그룹과 가짜 수술 그룹에 비해 NPE 그룹의 IL-4 및 IL-17 단백질 수준이 크게 증가했습니다(P < 0.05). 가짜 수술 그룹과 비교하여 ME 그룹의 IL-4 및 IL-17 단백질 수준도 통계적으로 유의미한 변화에 도달하지 못했습니다(P> 0.05).
(A) NPE 그룹의 IL-4 및 IL-17 단백질 수준은 ME 그룹 및 위약 그룹의 단백질 수준보다 유의하게 높았습니다(P < 0.05). (B) 웨스턴 블롯 히스토그램.
수술 중에 얻은 인간 샘플의 수가 제한되어 있기 때문에 MC의 병인에 대한 명확하고 상세한 연구는 다소 어렵습니다. 우리는 잠재적인 병리학적 메커니즘을 연구하기 위해 MC의 동물 모델을 확립하려고 시도했습니다. 동시에, NP 자가이식에 의해 유도된 MC의 과정을 추적하기 위해 방사선학적 평가, 조직학적 평가 및 분자생물학적 평가를 사용했습니다. 그 결과, NP 이식 모델은 12주에서 20주 시점까지 신호 강도가 점진적으로 변화하여(T1W 시퀀스의 낮은 신호와 T2W 시퀀스의 낮은 신호 혼합) 조직 변화를 나타내며 조직학적, 분자적 생물학적 평가를 통해 방사선학적 연구 결과가 확인되었습니다.
본 실험의 결과는 NPE군에서 척추체 침해 부위에 시각적, 조직학적 변화가 일어났음을 보여준다. 동시에 IL-4, IL-17, IFN-γ 유전자와 IL-4, IL-17, IFN-γ 유전자의 발현도 관찰되었는데, 이는 척추의 자가 속질핵 조직이 침해되었음을 의미한다. 신체는 일련의 신호 및 형태학적 변화를 일으킬 수 있습니다. 동물 모델 척추체의 신호 특성(T1W 시퀀스의 낮은 신호, T2W 시퀀스의 혼합 신호 및 낮은 신호)이 인간 척추 세포의 신호 특성과 매우 유사하다는 것을 쉽게 알 수 있으며, MRI 특성도 조직학 및 전체 해부학의 관찰을 확인합니다. 즉, 척추체 세포의 변화가 점진적입니다. 급성 외상으로 인한 염증 반응은 천자 직후에 나타날 수 있지만, MRI 결과는 점진적으로 증가하는 신호 변화가 천자 후 12주에 나타나고 MRI 변화의 회복이나 반전 징후 없이 최대 20주까지 지속되는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 자가 척추 NP가 토끼에서 진행성 MV를 확립하는 신뢰할 수 있는 방법임을 시사합니다.
이 천자 모델에는 적절한 기술, 시간 및 수술 노력이 필요합니다. 예비 실험에서 척추 주위 인대 구조의 해부 또는 과도한 자극으로 인해 척추 골극이 형성될 수 있습니다. 인접한 디스크를 손상시키거나 자극하지 않도록 주의해야 합니다. 일관되고 재현 가능한 결과를 얻으려면 침투 깊이를 제어해야 하기 때문에 3mm 길이의 바늘 덮개를 잘라 수동으로 플러그를 만들었습니다. 이 플러그를 사용하면 척추체에 균일한 드릴링 깊이가 보장됩니다. 예비 실험에서 수술에 참여한 세 명의 정형외과 의사는 18게이지 바늘이나 다른 방법보다 16게이지 바늘이 작업하기 더 쉽다는 것을 발견했습니다. 드릴링 중에 과도한 출혈을 피하기 위해 바늘을 잠시 동안 가만히 잡고 있으면 더 적합한 삽입 구멍이 제공될 것이며, 이는 이러한 방식으로 어느 정도 MC를 제어할 수 있음을 시사합니다.
많은 연구가 MC를 표적으로 삼았지만 MC25,26,27의 병인 및 발병기전에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이전 연구를 바탕으로 우리는 자가면역이 MC12의 발생과 발달에 중요한 역할을 한다는 것을 발견했습니다. 본 연구에서는 항원 자극 후 CD4+ 세포의 주요 분화 경로인 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 정량적 발현을 조사했습니다. 본 연구에서는 음성군에 비해 NPE군에서 IL-4, IL-17, IFN-γ의 발현이 높았고, IL-4, IL-17의 단백질 수준도 높았다.
임상적으로 IL-17 mRNA 발현은 추간판 탈출증 환자의 NP 세포에서 증가합니다. IL-4 및 IFN-γ 발현 수준의 증가는 건강한 대조군과 비교하여 급성 비압축성 추간판 탈출증 모델에서도 발견되었습니다. IL-17은 염증, 자가면역 질환의 조직 손상에서 중요한 역할을 하며30 IFN-γ31에 대한 면역 반응을 향상시킵니다. MRL/lpr 마우스32 및 자가면역에 민감한 마우스33에서 향상된 IL-17 매개 조직 손상이 보고되었습니다. IL-4는 전염증성 사이토카인(예: IL-1β 및 TNFα)의 발현과 대식세포 활성화를 억제할 수 있습니다. IL-4의 mRNA 발현은 동일한 시점에서 IL-17 및 IFN-γ와 비교하여 NPE 그룹에서 다른 것으로 보고되었습니다. NPE 그룹에서 IFN-γ의 mRNA 발현은 다른 그룹보다 유의하게 높았습니다. 따라서 IFN-γ 생산은 NP 삽입에 의해 유발되는 염증 반응의 매개체가 될 수 있습니다. 연구에 따르면 IFN-γ는 활성화된 1형 보조 T 세포, 자연 살해 세포 및 대식세포35,36를 포함한 여러 세포 유형에 의해 생성되며 면역 반응을 촉진하는 핵심 염증 유발 사이토카인입니다37.
이 연구는 자가면역 반응이 MC의 발생과 발달에 관여할 수 있음을 시사합니다. Luomaet al. MC와 눈에 띄는 NP의 신호 특성은 MRI에서 유사하며 둘 다 T2W 시퀀스에서 높은 신호를 나타냄을 발견했습니다. IL-139와 같은 일부 사이토카인은 MC의 발생과 밀접한 관련이 있는 것으로 확인되었습니다. Maet al. NP의 상향 또는 하향 돌출이 MC12의 발생 및 발달에 큰 영향을 미칠 수 있음을 시사했습니다. Bobechko40과 Herzbein 등41은 NP는 태어날 때부터 혈관 순환에 들어갈 수 없는 면역관용성 조직이라고 보고했습니다. NP 돌출은 혈액 공급에 이물질을 유입시켜 국소 자가면역 반응을 중재합니다42. 자가면역 반응은 수많은 면역 인자를 유발할 수 있으며, 이러한 인자가 조직에 지속적으로 노출되면 신호 전달에 변화를 일으킬 수 있습니다43. 본 연구에서는 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 과발현이 전형적인 면역 인자이며, 이는 NP와 MCs44 사이의 밀접한 관계를 더욱 입증합니다. 이 동물 모델은 NP 돌파 및 엔드 플레이트 진입을 잘 모방합니다. 이 과정은 자가면역이 MC에 미치는 영향을 추가로 밝혀냈습니다.
예상대로, 이 동물 모델은 우리에게 MC를 연구할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 그러나 이 모델에는 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 동물 관찰 단계에서 일부 중간 단계 토끼는 조직학 및 분자 생물학 테스트를 위해 안락사되어야 하므로 일부 동물은 시간이 지남에 따라 "사용이 중단됩니다". 둘째, 본 연구에서는 세 가지 시점을 설정했지만 안타깝게도 한 가지 유형의 MC(Modic type I 변경)만 모델링했기 때문에 인간의 질병 발달 과정을 대표하기에는 충분하지 않으며 더 많은 시점을 설정할 필요가 있습니다. 모든 신호 변화를 더 잘 관찰하십시오. 셋째, 조직 구조의 변화는 실제로 조직학적 염색을 통해 명확하게 표시될 수 있지만 일부 특수 기술은 이 모델의 미세 구조 변화를 더 잘 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 토끼 추간판45에서 섬유연골의 형성을 분석하기 위해 편광 현미경 검사법이 사용되었습니다. MC와 종판에 대한 NP의 장기적인 영향에 대해서는 추가 연구가 필요합니다.
54마리의 수컷 뉴질랜드 흰토끼(체중 약 2.5~3kg, 생후 3~3.5개월)를 무작위로 가짜 수술군, 근육 이식군(ME군), 신경근 이식군(NPE군)으로 나누었습니다. 모든 실험 절차는 천진병원 윤리위원회의 승인을 받았으며, 실험 방법은 승인된 지침에 따라 엄격하게 수행되었습니다.
S. Sobajima 46 의 수술 기법이 일부 개선되었습니다. 각 토끼를 측면 누운 자세로 놓고 5개의 연속적인 요추 추간판(IVD)의 전면을 후외측 후복막 접근법을 사용하여 노출시켰습니다. 각 토끼에게 전신 마취(20% 우레탄, 귀 정맥을 통해 5ml/kg)를 실시했습니다. 갈비뼈의 아래쪽 가장자리부터 골반 가장자리까지 척추 주위 근육의 복부 2cm에 세로 피부 절개를 실시했습니다. L1에서 L6까지의 오른쪽 전외측 척추는 위에 있는 피하 조직, 후복막 조직 및 근육을 날카롭고 무딘 절개로 노출시켰습니다(그림 6A). 디스크 레벨은 L5-L6 디스크 레벨에 대한 해부학적 기준점으로 골반 가장자리를 사용하여 결정되었습니다. 16게이지 천자 바늘을 사용하여 L5 척추의 끝판 근처에 구멍을 3mm 깊이까지 뚫습니다(그림 6B). 5ml 주사기를 사용하여 L1-L2 추간판의 자가 핵 속질을 흡인합니다(그림 6C). 각 그룹의 요구 사항에 따라 속질핵이나 근육을 제거합니다. 드릴 구멍을 깊게 한 후, 수술 중 척추체의 골막 조직이 손상되지 않도록 주의하면서 심부 근막, 표면 근막 및 피부에 흡수성 봉합사를 삽입합니다.
(A) L5-L6 디스크는 후측 후복막 접근법을 통해 노출됩니다. (B) 16게이지 바늘을 사용하여 L5 엔드플레이트 근처에 구멍을 뚫습니다. (C)자가 MF가 수확됩니다.
전신마취는 20% 우레탄(5 ml/kg)을 귀 정맥을 통해 투여하였고, 수술 후 12, 16, 20주에 요추 방사선 사진을 반복 촬영하였다.
수술 후 12, 16, 20주에 케타민(25.0 mg/kg)과 펜토바르비탈 나트륨(1.2 g/kg)을 근육 내 주사하여 토끼를 희생시켰습니다. 조직학적 분석을 위해 전체 척추를 제거하고 실제 분석을 수행했습니다. 정량적 역전사(RT-qPCR)와 Western blotting을 사용하여 면역 인자의 변화를 감지했습니다.
MRI 검사는 직각 사지 코일 수신기가 장착된 3.0 T 임상 자석(GE Medical Systems, Florence, SC)을 사용하여 토끼에서 수행되었습니다. 토끼를 귀 정맥을 통해 20% 우레탄(5mL/kg)으로 마취시킨 후 요추 부위를 5인치 직경의 원형 표면 코일(GE Medical Systems) 중심으로 자석 내에 반듯이 눕혔습니다. L3-L4에서 L5-L6까지 요추 디스크의 위치를 정의하기 위해 Coronal T2 강조 로컬라이저 이미지(TR, 1445ms, TE, 37ms)를 획득했습니다. 시상면 T2 가중 슬라이스는 다음 설정으로 획득되었습니다: 반복 시간(TR)이 2200ms이고 에코 시간(TE)이 70ms인 빠른 스핀-에코 시퀀스, 매트릭스; 260° 시야 및 8개 자극; 절단 두께는 2mm, 간격은 0.2mm입니다.
마지막 사진을 촬영하고 마지막 토끼를 죽인 후 조직학적 검사를 위해 가짜 디스크, 근육 내장 디스크, NP 디스크를 제거했습니다. 조직을 1주 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고 에틸렌디아민테트라아세트산으로 석회질을 제거한 후 파라핀 절편을 만들었습니다. 조직 블록을 파라핀에 삽입하고 마이크로톰을 사용하여 시상 단면(두께 5μm)으로 절단했습니다. 절편은 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색되었습니다.
각 그룹의 토끼로부터 추간판을 채취한 후 제조사의 지시에 따라 UNIQ-10 컬럼(Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China)과 ImProm II 역전사 시스템(Promega Inc.)을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. , 매디슨, 위스콘신, 미국). 역전사가 수행되었습니다.
RT-qPCR은 Prism 7300(Applied Biosystems Inc., USA) 및 SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. PCR 반응 부피는 20μl였으며 희석된 cDNA 1.5μl와 각 프라이머 0.2μM을 포함했습니다. 프라이머는 OligoPerfect Designer(Invitrogen, Valencia, CA)가 설계하고 Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd.(중국)에서 제조했습니다(표 1). 다음과 같은 열 순환 조건이 사용되었습니다: 94°C에서 2분 동안 초기 중합효소 활성화 단계, 이후 주형 변성을 위해 94°C에서 각각 15초씩 40주기, 60°C에서 1분 동안 어닐링, 확장 및 형광. 측정은 72°C에서 1분 동안 수행되었습니다. 모든 샘플은 3회 증폭되었으며 평균값은 RT-qPCR 분석에 사용되었습니다. 증폭 데이터는 FlexStation 3(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 분석되었습니다. IL-4, IL-17 및 IFN-γ 유전자 발현은 내인성 대조군(ACTB)에 대해 표준화되었습니다. 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 표적 mRNA의 상대적 발현 수준을 계산했습니다.
RIPA 용해 완충액(프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 함유)에서 조직 균질기를 사용하여 조직에서 총 단백질을 추출한 다음 4°C에서 20분간 13,000rpm으로 원심분리하여 조직 잔해를 제거했습니다. 레인당 50 마이크로그램의 단백질을 로딩하고, 10% SDS-PAGE로 분리한 후 PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. 차단은 0.1% Tween 20을 함유한 Tris 완충 식염수(TBS)에 용해된 5% 무지방 분유에서 실온에서 1시간 동안 수행되었습니다. 막을 토끼 항-데코린 1차 항체(1:200 희석; Boster, 중국 우한)(1:200 희석; Bioss, 중국 베이징)와 함께 밤새 4°C에서 배양하고 둘째 날에 반응시켰습니다. 2차 항체(염소 항토끼 면역글로불린 G, 1:40,000 희석)와 고추냉이 퍼옥시다제(Boster, 중국 우한)를 실온에서 1시간 동안 결합했습니다. X선 조사 후 화학발광막의 화학발광이 증가하여 웨스턴 블롯 신호가 검출되었습니다. 농도계 분석을 위해 BandScan 소프트웨어를 사용하여 블롯을 스캔하고 정량화했으며 결과를 튜불린 면역반응성에 대한 표적 유전자 면역반응성의 비율로 표시했습니다.
통계 계산은 SPSS16.0 소프트웨어 패키지(SPSS, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 연구 기간 동안 수집된 데이터는 평균 ± 표준편차(평균 ± SD)로 표현되었으며 일원 반복 측정 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석되어 두 그룹 간의 차이를 확인했습니다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
따라서 자가유래 NP를 척추체에 이식하고 거대해부학적 관찰, MRI 분석, 조직학적 평가 및 분자생물학적 분석을 수행하여 MC의 동물 모델을 확립하는 것은 인간 MC의 메커니즘을 평가 및 이해하고 새로운 치료법을 개발하는 데 중요한 도구가 될 수 있습니다 개입.
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게시 시간: 2024년 12월 13일