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MC (Modic Change)의 동물 모델 확립은 MC를 공부하는 데 중요한 기초입니다. 54 개 뉴질랜드 흰 토끼는 가짜 수용 그룹, Muscle Implantation Group (ME Group) 및 Nucleus Pulposus Implantation Group (NPE Group)으로 나뉘 었습니다. NPE 그룹에서, 인터뷰 디스크는 전측 요추 외과 접근법에 의해 노출되었고 바늘을 사용하여 끝 플레이트 근처의 L5 척추 몸체를 뚫었다. NP는 주사기에 의해 L1/2 추간판 디스크로부터 추출되어 주사 하였다. 연골 뼈에 구멍을 뚫습니다. 근육 이식 그룹 및 가짜 수용 그룹의 수술 절차 및 시추 방법은 NP 이식 그룹의 것과 동일했습니다. ME 그룹에서는 근육 조각을 구멍에 넣고 가짜 수용 그룹에서는 구멍에 아무것도 놓지 않았습니다. 수술 후, MRI 스캐닝 및 분자 생물학적 시험을 수행 하였다. NPE 그룹의 신호는 변경되었지만 Sham-Operation Group 및 ME 그룹에는 명백한 신호 변화가 없었습니다. 조직 학적 관찰은 이식 부위에서 비정상적인 조직 증식이 관찰되었으며, IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 발현이 NPE 그룹에서 증가 하였다. 연골 하 뼈에 NP를 이식하면 MC의 동물 모델을 형성 할 수 있습니다.
MODIC 변화 (MC)는 척추 종말점의 병변이며 자기 공명 영상 (MRI)에서는 인접한 골수가 보입니다. 그것들은 관련 증상이있는 개인에게 매우 흔합니다 1. 많은 연구에 따르면 요통 (LBP) 2,3과의 연관성으로 인해 MC의 중요성을 강조했습니다. De Roos et al.4 및 Modic et al.5는 척추 골수에서 3 가지 다른 유형의 하위 분해 서체 신호 이상을 독립적으로 설명했다. Modic Type I 변화는 T1- 가중 (T1W) 서열에서 hypointense이고 T2-weighted (T2W) 서열에서 과도. 이 병변은 골수에서 균열 엔드 플레이트와 인접한 혈관 과립 조직을 나타냅니다. Modic Type II 변화는 T1W 및 T2W 서열 모두에서 높은 신호를 나타낸다. 이러한 유형의 병변에서, 인접한 골수의 조직 학적 지방 대체뿐만 아니라 엔드 플레이트 파괴가 발견 될 수있다. Modic Type III 변경은 T1W 및 T2W 서열에서 낮은 신호를 나타낸다. 엔드 플레이트에 상응하는 경화성 병변이 관찰되었다. MC는 척추의 병리학 적 질병으로 간주되며 척추의 많은 퇴행성 질환과 밀접한 관련이 있습니다.
이용 가능한 데이터를 고려할 때, 여러 연구에서 MC의 병인 및 병리학 적 메커니즘에 대한 자세한 통찰력을 제공했습니다. Albert et al. MC는 디스크 탈장에 의해 야기 될 수 있다고 제안했다. Hu et al. MC가 심각한 디스크 변성으로 인한 것입니다 .10. KROC는“내부 디스크 파열”의 개념을 제안했는데, 이는 반복적 인 디스크 외상이 엔드 플레이트에서 마이크로웨어로 이어질 수 있다고 말합니다. 갈라진 형성 후, 핵 pulposus (NP)에 의한 엔드 플레이트 파괴는자가 면역 반응을 유발할 수 있으며, 이는 MC11의 발달로 이어질 수있다. Ma et al. 유사한 견해를 공유하고 NP- 유도 된자가 면역이 MC12의 발병에 중요한 역할을한다고보고했다.
면역계 세포, 특히 CD4+ T 헬퍼 림프구는자가 면역의 발병 기전에서 중요한 역할을한다. 최근에 발견 된 Th17 서브 세트는 전 염증성 사이토 카인 IL-17을 생성하고, 케모카인 발현을 촉진하며, 손상된 기관에서 T 세포를 자극하여 IFN-γ14를 생성한다. Th2 세포는 또한 면역 반응의 발병 기전에서 독특한 역할을한다. 대표적인 Th2 세포로서 IL-4의 발현은 심각한 면역 병리학 적 결과를 초래할 수있다.
많은 임상 연구가 MC16,17,18,19,21,21,22,23,24에 대해 수행되었지만 여전히 인간에서 발생하고 자주 발생하는 MC 프로세스를 모방 할 수있는 적절한 동물 실험 모델이 여전히 부족합니다. 병인 또는 표적 요법과 같은 새로운 치료법을 조사하는 데 사용됩니다. 현재까지, MC의 몇 가지 동물 모델만이 근본적인 병리학 적 메커니즘을 연구하는 것으로보고되었습니다.
Albert와 MA가 제안한자가 면역 이론에 기초하여,이 연구는 드릴 척추 끝 플레이트 근처에서 NP를자가 유도함으로써 간단하고 재현 가능한 토끼 MC 모델을 확립했습니다. 다른 목표는 동물 모델의 조직 학적 특성을 관찰하고 MC 개발에서 NP의 특정 메커니즘을 평가하는 것입니다. 이를 위해, 우리는 분자 생물학, MRI 및 조직 학적 연구와 같은 기술을 사용하여 MC의 진행을 연구합니다.
2 개의 토끼는 수술 중에 출혈로 사망했으며, MRI 동안 마취 중에 4 명의 토끼가 사망했습니다. 나머지 48 개의 토끼는 살아남아 수술 후 행동 또는 신경 학적 징후를 보이지 않았다.
MRI는 상이한 구멍에서 내장 된 조직의 신호 강도가 다르다는 것을 보여준다. NPE 그룹에서 L5 척추체의 신호 강도는 삽입 후 12, 16 및 20 주에 점차적으로 변경되었으며 (T1W 서열은 낮은 신호를 보였고, T2W 서열은 혼합 신호 + 낮은 신호를 나타냈다) (도 1C) MRI. 다른 두 그룹의 임베디드 부품 그룹은 같은 기간 동안 비교적 안정적으로 유지되었다 (도 1A, B).
(a) 3 시점에서 토끼 요추의 대표적인 순차적 MRI. 가짜 수용 그룹의 이미지에서 신호 이상이 발견되지 않았다. (b) ME 그룹에서 척추 본체의 신호 특성은 가짜 수용 그룹의 신호 특성과 유사하며, 임베딩 부위에서 시간이 지남에 따라 유의 한 신호 변화는 관찰되지 않습니다. (c) NPE 그룹에서, 낮은 신호는 T1W 시퀀스에서 명확하게 볼 수 있으며, 혼합 신호 및 낮은 신호는 T2W 서열에서 명확하게 볼 수있다. 12 주에서 20 주까지, T2W 시퀀스의 낮은 신호를 둘러싼 산발적 인 높은 신호가 감소합니다.
NPE 그룹의 척추체의 이식 부위에서 명백한 뼈 과형성이 볼 수 있으며, 뼈 과형성은 NPE 그룹에 비해 12 주에서 20 주로 더 빨리 발생하지만 모델링 된 척추 동물에서는 유의 한 변화가 관찰되지 않습니다. 몸; Sham Group 및 ME 그룹 (도 2C) 2A, B).
(a) 이식 된 부분의 척추 표면은 매우 매끄럽고 구멍은 잘 치유되며 척추에 과형성이 없습니다. (b) ME 그룹에서 이식 된 부위의 형상은 가짜 작동 그룹의 형상과 유사하며, 시간이 지남에 따라 이식 된 부위의 출현에는 명백한 변화가 없다. (c) 뼈 비대증은 NPE 그룹의 이식 된 부위에서 발생 하였다. 뼈 과형성은 빠르게 증가하고 심지어 인터뷰 디스크를 통해 반대쪽 척추 몸으로 확장되었습니다.
조직 학적 분석은 뼈 형성에 대한보다 자세한 정보를 제공합니다. 그림 3은 수술 후 섹션의 사진을 H & E로 염색합니다. 가짜 수용 그룹에서, 연골 세포는 잘 배열되었고 세포 증식은 검출되지 않았다 (도 3A). ME 그룹의 상황은 가짜 수용 그룹의 상황과 유사 하였다 (도 3B). 그러나, NPE 그룹에서, 이식 부위에서 다수의 연골 세포 및 NP- 유사 세포의 증식이 관찰되었다 (도 3C);
(a) trabeculae는 끝 플레이트 근처에서 볼 수 있으며, 연골 세포는 균일 한 세포 크기 및 형상으로 깔끔하게 배열되며 (40 회). (b) ME 그룹의 이식 부위의 조건은 가짜 그룹의 상태와 유사하다. trabeculae 및 연골 세포는 볼 수 있지만, 이식 부위 (40 회)에서 명백한 증식은 없습니다. (b) 연골 세포 및 NP- 유사 세포가 크게 증식하고 연골 세포의 모양과 크기가 고르지 않음을 알 수있다 (40 회).
인터루킨 4 (IL-4) mRNA, 인터루킨 17 (IL-17) mRNA 및 인터페론 γ (IFN-γ) mRNA의 발현은 NPE 및 ME 그룹 모두에서 관찰되었다. 표적 유전자의 발현 수준이 비교되었을 때, IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 유전자 발현은 ME 그룹 및 가짜 작동 그룹의 것과 비교하여 NPE 그룹에서 유의하게 증가되었다 (도 4). (P <0.05). 가짜 작동 그룹과 비교하여, ME 그룹에서 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 발현 수준은 약간만 증가했으며 통계적 변화에 도달하지 않았다 (p> 0.05).
NPE 그룹에서 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 mRNA 발현은 가짜 작전 그룹 및 ME 그룹의 경향보다 상당히 높은 경향을 나타냈다 (P <0.05).
대조적으로, ME 그룹의 발현 수준은 유의 한 차이를 나타내지 않았다 (p> 0.05).
웨스턴 블롯 분석은 IL-4 및 IL-17에 대한 상업적으로 이용 가능한 항체를 사용하여 수행되어 변경된 mRNA 발현 패턴을 확인 하였다. ME 그룹 및 가짜 수술 그룹과 비교하여도 5a, B에 도시 된 바와 같이, NPE 그룹에서 IL-4 및 IL-17의 단백질 수준이 상당히 증가 하였다 (P <0.05). 가짜 수술 그룹과 비교하여, ME 그룹에서 IL-4 및 IL-17의 단백질 수준도 통계적으로 유의 한 변화에 도달하지 못했다 (p> 0.05).
(A) NPE 그룹에서 IL-4 및 IL-17의 단백질 수준은 ME 그룹 및 위약 그룹의 단백질 수준보다 유의하게 높았다 (P <0.05). (b) 웨스턴 블롯 히스토그램.
수술 중에 얻은 제한된 수의 인간 샘플로 인해 MC의 발병 기전에 대한 명확하고 상세한 연구가 다소 어렵다. 우리는 잠재적 인 병리학 적 메커니즘을 연구하기 위해 MC의 동물 모델을 확립하려고 시도했다. 동시에, 방사선 학적 평가, 조직 학적 평가 및 분자 생물학적 평가를 사용하여 NP자가 이식에 의해 유도 된 MC 과정을 따랐다. 결과적으로, NP 이식 모델은 12 주 내지 20 주 내지 20 주 시점 (T1W 서열의 혼합 된 낮은 신호 및 T2W 서열의 낮은 신호) 및 조직 학적 및 분자를 나타내는 신호 강도의 점진적인 변화를 초래했다. 생물학적 평가는 방사선 연구 결과를 확인했습니다.
이 실험의 결과는 NPE 그룹의 척추 신체 침해 부위에서 시각적 및 조직 학적 변화가 발생했음을 보여준다. 동시에, IL-4, IL-17 및 IFN-γ 유전자뿐만 아니라 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 발현이 관찰되었으며, 이는 척추에서자가 핵 pulposus 조직의 침해가 관찰되었다. 신체는 일련의 신호와 형태 학적 변화를 일으킬 수 있습니다. 동물 모델의 척추 본체 (T1W 서열의 낮은 신호, 혼합 신호 및 T2W 서열의 낮은 신호)의 신호 특성이 인간 척추 세포와 매우 유사하다는 것을 쉽게 알 수 있습니다. 조직학 및 총 해부학의 관찰을 확인하십시오. 즉, 척추 세포의 변화는 점진적입니다. 급성 외상으로 인한 염증 반응은 천공 후 곧 나타날 수 있지만, MRI 결과는 펑크 후 12 주 후에 점진적으로 증가하는 신호 변화가 나타나고 MRI 변화의 징후 또는 반전의 징후없이 최대 20 주 동안 지속됨을 보여 주었다. 이러한 결과는자가 척추 NP가 토끼에서 진행성 MV를 확립하기위한 신뢰할 수있는 방법임을 시사한다.
이 천자 모델에는 적절한 기술, 시간 및 외과 적 노력이 필요합니다. 예비 실험에서, 자막 인대 구조의 해부 또는 과도한 자극은 척추 골다공증의 형성을 초래할 수있다. 인접한 디스크를 손상 시키거나 자극하지 않도록주의해야합니다. 일관되고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 침투 깊이를 제어해야하므로 3mm 긴 바늘의 칼집을 절단하여 수동으로 플러그를 만들었습니다. 이 플러그를 사용하면 척추의 균일 한 드릴링 깊이를 보장합니다. 예비 실험에서, 작전에 관련된 3 명의 정형 외과 의사가 16 게이지 바늘이 18 게이지 바늘 또는 기타 방법으로 작업하기가 더 쉽다는 것을 발견했습니다. 드릴링 중에 과도한 출혈을 피하기 위해 바늘을 잠시 동안 유지하면 더 적합한 삽입 구멍을 제공하여 어느 정도의 MC가 이러한 방식으로 제어 될 수 있음을 시사합니다.
많은 연구가 MC를 목표로했지만 MC25,26,27의 병인과 병인에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 이전 연구를 바탕으로, 우리는자가 면역이 MC12의 발생과 발달에 중요한 역할을한다는 것을 발견했습니다. 이 연구는 항원 자극 후 CD4+ 세포의 주요 분화 경로 인 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 정량적 발현을 조사 하였다. 우리의 연구에서, 음성 그룹과 비교하여, NPE 그룹은 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 발현이 더 높았으며, IL-4 및 IL-17의 단백질 수준도 더 높았다.
임상 적으로, IL-17 mRNA 발현은 디스크 탈장 환자로부터 NP 세포에서 증가된다. 증가 된 IL-4 및 IFN-γ 발현 수준은 또한 건강한 대조군과 비교하여 급성 비 압축 디스크 탈출 모델에서 발견되었다. IL-17은자가 면역 질환에서 염증, 조직 손상에 중요한 역할을하며 IFN-γ31에 대한 면역 반응을 향상시킵니다. 향상된 IL-17- 매개 조직 손상은 MRL/LPR 마우스 32 및자가 면역 감수성 마우스에서보고되었다. IL-4는 전 염증성 사이토 카인 (예 : IL-1β 및 TNFα) 및 대 식세포 활성화의 발현을 억제 할 수있다. IL-4의 mRNA 발현은 동일한 시점에서 IL-17 및 IFN-γ와 비교하여 NPE 그룹에서 상이한 것으로보고되었다; NPE 그룹에서 IFN-γ의 mRNA 발현은 다른 그룹의 mRNA 발현보다 상당히 높았다. 따라서, IFN-γ 생산은 NP 삽입에 의해 유도 된 염증 반응의 매개체 일 수있다. 연구에 따르면 IFN-γ는 활성화 된 유형 1 도우미 T 세포, 자연 살해 세포 및 대 식세포 35,36을 포함한 다수의 세포 유형에 의해 생성되며, 면역 반응을 촉진하는 주요 전 염증성 사이토 카인이다.
이 연구는자가 면역 반응이 MC의 발생 및 발달에 관여 할 수 있음을 시사한다. Luoma et al. MC 및 유명한 NP의 신호 특성은 MRI에서 유사하며, 둘 다 T2W 시퀀스 38에서 높은 신호를 나타낸다는 것을 발견했다. 일부 사이토 카인은 IL-139와 같은 MC 발생과 밀접한 관련이있는 것으로 확인되었습니다. Ma et al. NP의 상향 또는 하향 돌출은 MC12의 발생 및 발달에 큰 영향을 줄 수 있다고 제안했다. Bobechko40과 Herzbein et al.41은 NP가 출생부터 혈관 순환에 들어갈 수없는 면역상 조직이라고보고했다. NP 돌출부는 이물질을 혈액 공급에 소개하여 국소자가 면역 반응을 매개한다. 자가 면역 반응은 많은 면역 인자를 유발할 수 있으며, 이러한 요인이 조직에 지속적으로 노출되면 신호 전달의 변화를 일으킬 수 있습니다. 이 연구에서, IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 과발현은 전형적인 면역 인자이며, 이는 NP와 MCS44 사이의 밀접한 관계를 더욱 입증한다. 이 동물 모델은 NP 혁신과 엔드 플레이트로의 진입을 잘 모방합니다. 이 과정은자가 면역이 MC에 미치는 영향을 추가로 밝혀 냈습니다.
예상 대로이 동물 모델은 MC를 공부할 수있는 플랫폼을 제공합니다. 그러나이 모델에는 여전히 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 동물 관찰 단계에서 일부 중간 단계 토끼는 조직 학적 및 분자 생물학 테스트를 위해 안락사해야하므로 일부 동물은 시간이 지남에 따라 사용되지 않습니다. 둘째,이 연구에서 3 개의 시점이 설정되었지만 불행히도, 우리는 한 유형의 MC (Modic Type I Change) 만 모델링 했으므로 인간 질병 발달 과정을 나타내는 것만으로는 충분하지 않으며 더 많은 시점을 설정해야합니다. 모든 신호 변경을 더 잘 관찰하십시오. 셋째, 조직 구조의 변화는 실제로 조직 학적 염색에 의해 명확하게 나타날 수 있지만, 일부 특수 기술은이 모델의 미세 구조적 변화를 더 잘 드러 낼 수있다. 예를 들어, 편광 현미경을 사용하여 토끼 절벽 디스크에서 섬유 성분의 형성을 분석 하였다. MC 및 엔드 플레이트에 대한 NP의 장기 효과는 추가 연구가 필요합니다.
54 명의 수컷 뉴질랜드 백색 토끼 (약 2.5-3kg, 3-3.5 개월)는 무작위로 가짜 수술 그룹, ME 그룹 (ME Group) 및 Nerve Root Implantation Group (NPE 그룹)으로 무작위로 나뉘 었습니다. 모든 실험 절차는 Tianjin Hospital의 윤리위원회에 의해 승인되었으며, 실험 방법은 승인 된 지침에 따라 엄격하게 수행되었습니다.
S. Sobajima 46의 외과 기술이 일부 개선되었습니다. 각각의 토끼를 측면의 반복 위치에 놓고 5 개의 연속 요추 추간판 (IVDS)의 전방 표면을 후측 후체 환체 주변 접근법을 사용하여 노출시켰다. 각각의 토끼에게 전신 마취 (귀 정맥을 통해 20% 우레탄, 5 mL/kg)를 제공 하였다. 세로 피부 절개는 갈비뼈의 아래쪽 가장자리에서 골반 챙까지, 2cm의 복부 근육까지 이루어졌다. L1에서 L6에서 L6에서 L6까지의 오른쪽 전방 척추는 위에있는 피하 조직, 후체 조직 및 근육의 날카롭고 무딘 해부에 의해 노출되었다 (도 6a). 디스크 레벨은 골반 챙을 L5-L6 디스크 레벨의 해부학 적 랜드 마크로 사용하여 결정되었다. 16- 게이지 천자 바늘을 사용하여 L5 척추의 끝 플레이트 근처의 구멍을 3mm 깊이까지 뚫습니다 (그림 6b). 5ml 주사기를 사용하여 L1-L2 인터뷰 디스크에서자가 핵 펄 포스를 흡인하십시오 (그림 6C). 각 그룹의 요구 사항에 따라 핵면 또는 근육을 제거하십시오. 드릴 구멍이 심화 된 후, 흡수성 봉합사는 깊은 근막, 피상적인 근막 및 피부에 배치되어 수술 중에 척추의 골막 조직을 손상시키지 않도록주의합니다.
(a) L5 – L6 디스크는 후측 후체 접근법을 통해 노출됩니다. (b) 16 게이지 바늘을 사용하여 L5 엔드 플레이트 근처에 구멍을 뚫습니다. (c)자가 MFS가 수확됩니다.
전신 마취를 귀 정맥을 통해 20% 우레탄 (5 mL/kg)으로 투여하였고, 수술 후 12, 16 및 20 주에 요추 방사선 사진을 반복 하였다.
수술 후 12, 16 및 20 주에 케타민 (25.0 mg/kg) 및 정맥 내 나트륨 펜토 바르 비탈 (1.2 g/kg)의 근육 내 주사에 의해 토끼를 희생시켰다. 조직 학적 분석을 위해 전체 척추를 제거하고 실제 분석을 수행 하였다. 정량적 역전사 (RT-QPCR) 및 웨스턴 블 롯팅을 사용하여 면역 인자의 변화를 감지 하였다.
MRI 검사는 직교 사지 코일 수신기가 장착 된 3.0 T Clinical Magnet (GE Medical Systems, Florence, SC)을 사용하여 토끼에서 수행되었다. 토끼를 귀 정맥을 통해 20% 우레탄 (5 mL/kg)으로 마취시킨 다음 5 인치 직경 원형 표면 코일 (GE Medical Systems)을 중심으로 요추 영역과 자석 내에 앙와위를 놓았습니다. L3-L4에서 L5-L6에서 L5-L6에서 Lumbar 디스크의 위치를 정의하기 위해 관상 T2 가중 지역화 이미지 (TR, 1445ms; TE, 37ms)를 획득 하였다. 시상면 T2 가중 슬라이스는 다음과 같은 설정으로 획득되었습니다 : 2200ms의 반복 시간 (TR) 및 70ms의 에코 시간 (TE), 매트릭스; 260 및 8 자극의 시야; 절단 두께는 2 mm이고, 갭은 0.2 mm였다.
마지막 사진이 찍히고 마지막 토끼가 사망 한 후, 가짜, 근육이 강화되었으며 NP 디스크가 조직 학적 검사를 위해 제거되었습니다. 조직을 1 주 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정 시켰으며, 에틸렌 리아 미네 테트라 아세트산으로 계산하고 파라핀을 절단 하였다. 조직 블록을 파라핀에 내장하고 마이크로톰을 사용하여 시상 섹션 (5 μm 두께)으로 절단 하였다. 섹션을 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)으로 염색 하였다.
각 그룹의 토끼로부터 인터뷰 디스크를 수집 한 후, 제조업체의 지침 및 즉락 II 역 전사 시스템 (Promega Inc. , Madison, WI, USA). 역전사가 수행되었다.
RT-QPCR은 제조업체의 지침에 따라 Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) 및 Sybr Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하여 수행되었습니다. PCR 반응 부피는 20 μL이고, 1.5 μL의 희석 된 cDNA 및 각각의 프라이머의 0.2 μM을 함유 하였다. 프라이머는 oligoperfect 설계자 (Invitrogen, Valencia, CA)에 의해 설계되었으며 Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (중국)에 의해 제조되었습니다 (표 1). 다음과 같은 열 사이클링 조건이 사용되었다 : 초기 폴리머 라제 활성화 단계는 94 ℃에서 2 분 동안,이어서 템플릿 변성을 위해 94 ℃에서 각각 15 초의 40 사이클, 60 ℃에서 1 분 동안 어닐링, 연장 및 형광을 사용 하였다. 측정은 72 ℃에서 1 분 동안 수행되었다. 모든 샘플을 3 회 증폭시키고 평균 값을 RT-QPCR 분석에 사용 하였다. FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)을 사용하여 증폭 데이터를 분석 하였다. IL-4, IL-17 및 IFN-γ 유전자 발현을 내인성 대조군 (ACTB)으로 정규화 하였다. 표적 mRNA의 상대 발현 수준은 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 계산되었다.
RIPA 용해 완충액 (프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유 한) 중 조직 균질화 제를 사용하여 조직으로부터 총 단백질을 추출한 다음, 4 ℃에서 20 분 동안 13,000 rpm에서 원심 분리하여 조직 파편을 제거 하였다. 50 마이크로 그램의 단백질을 차선 당 로딩하고 10% SDS-PAGE로 분리 한 다음 PVDF 막으로 옮겼다. 실온에서 1 시간 동안 0.1% 트윈 20을 함유하는 트리스-완충 식염수 (TBS)에서 5% 비 지방 건조 우유에서 차단을 수행 하였다. 막을 토끼 항-데코린 1 차 항체와 함께 배양 하였다 (1 : 200; 중국 우한, 바스터) (1 : 200; 중국 베이징, 바이오스) 4 ℃에서 밤새 반응 하였다; 2 차 항체 (1 : 40,000 희석액에서 염소 항-토끼 면역 글로불린 G)와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (Boster, Wuhan, Wuhan, Wuhan)와 결합하여 실온에서 1 시간 동안. X- 선 조사 후 화학 발광 막에서 증가 된 화학 발광에 의해 웨스턴 블롯 신호가 검출되었다. 밀도 측정 분석을 위해, 블롯을 스캔하고 밴드 스칸 소프트웨어를 사용하여 정량화하고, 결과를 튜 불린 면역 반응성에 대한 표적 유전자 면역 반응의 비로 표현 하였다.
SPSS16.0 소프트웨어 패키지 (SPSS, USA)를 사용하여 통계 계산을 수행 하였다. 연구 중에 수집 된 데이터는 평균 ± 표준 편차 (평균 ± SD)로 표현되었고 일회용 반복 측정 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 두 그룹 간의 차이를 결정 하였다. P <0.05는 통계적으로 유의 한 것으로 간주되었다.
따라서,자가 NPS를 척추 신체에 이식하고 거대 해부학 적 관찰을 수행함으로써 MC의 동물 모델의 확립, MRI 분석, 조직 학적 평가 및 분자 생물학적 분석은 인간 MC의 메커니즘을 평가하고 이해하는 데 중요한 도구가 될 수있다. 중재.
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시간 후 : 12 월 13 일 -2024 년