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추간판 변형(MC)의 동물 모델 확립은 MC 연구의 중요한 기초가 된다. 뉴질랜드 화이트 토끼 54마리를 대조군(가짜 수술군), 근육 이식군(ME군), 수핵 이식군(NPE군)으로 나누었다. NPE군에서는 전외측 요추 수술을 통해 추간판을 노출시키고, L5 척추체의 종판 부근에 바늘을 이용하여 천공했다. L1/2 추간판에서 수핵을 추출하여 주사기로 천공 부위에 주입하고, 연골하골에 구멍을 뚫었다. 근육 이식군과 가짜 수술군의 수술 절차 및 천공 방법은 NPE군과 동일했다. ME군에서는 근육 조각을 천공 부위에 삽입했고, 가짜 수술군에서는 아무것도 삽입하지 않았다. 수술 후 MRI 촬영과 분자생물학적 검사를 시행했다. NPE 그룹에서는 신호 변화가 관찰되었지만, 대조군과 ME 그룹에서는 뚜렷한 신호 변화가 없었다. 조직학적 관찰 결과, 이식 부위에서 비정상적인 조직 증식이 확인되었고, NPE 그룹에서 IL-4, IL-17, IFN-γ의 발현이 증가했다. 따라서 연골하골에 NP를 이식하면 MC 동물 모델을 형성할 수 있다.
모딕 변화(Modic changes, MC)는 자기공명영상(MRI)에서 관찰되는 척추 종판 및 인접 골수 병변입니다. 이러한 병변은 관련 증상을 동반하는 사람들에게서 흔히 나타납니다.1 많은 연구에서 MC가 요통(LBP)과 연관되어 있다는 점을 강조해 왔습니다.2,3 de Roos 등4과 Modic 등5은 각각 독립적으로 척추 골수에서 세 가지 유형의 연골하 신호 이상을 처음으로 기술했습니다. 모딕 제1형 변화는 T1 강조 영상(T1W)에서 저신호, T2 강조 영상(T2W)에서 고신호를 보입니다. 이 병변은 골수 내 종판 균열 및 인접 혈관 육아 조직을 나타냅니다. 모딕 제2형 변화는 T1W 및 T2W 영상 모두에서 고신호를 보입니다. 이 유형의 병변에서는 종판 파괴와 인접 골수의 지방 변성이 관찰될 수 있습니다. 모딕 제3형 변화는 T1W 및 T2W 영상 모두에서 저신호를 보입니다. 종판에 해당하는 경화성 병변이 관찰되었습니다6. MC는 척추의 병리학적 질환으로 간주되며 척추의 많은 퇴행성 질환과 밀접하게 관련되어 있습니다7,8,9.
지금까지 발표된 자료들을 종합해 보면, 여러 연구에서 MC의 원인과 병리학적 기전에 대한 자세한 통찰을 제공해 왔습니다. Albert 등은 MC가 추간판 탈출증으로 인해 발생할 수 있다고 제안했고8, Hu 등은 심각한 추간판 퇴행을 MC의 원인으로 지목했습니다10. Kroc은 반복적인 추간판 외상이 종판에 미세 파열을 일으킬 수 있다는 "내부 추간판 파열" 개념을 제시했습니다. 파열이 발생한 후, 수핵(NP)에 의한 종판 파괴가 자가면역 반응을 유발하고, 이는 결국 MC 발병으로 이어질 수 있다고 설명했습니다11. Ma 등도 유사한 견해를 제시하며 수핵 유발 자가면역이 MC 발병기전에 중요한 역할을 한다고 보고했습니다12.
면역계 세포, 특히 CD4+ T 도우미 림프구는 자가면역 질환의 병인에 중요한 역할을 합니다.13 최근에 발견된 Th17 세포 아형은 염증성 사이토카인 IL-17을 생성하고, 케모카인 발현을 촉진하며, 손상된 장기의 T 세포를 자극하여 IFN-γ를 생성하게 합니다.14 Th2 세포 또한 면역 반응의 병인에 독특한 역할을 합니다. 대표적인 Th2 세포인 IL-4의 발현은 심각한 면역병리학적 결과를 초래할 수 있습니다.15
MC에 대한 많은 임상 연구가 진행되었음에도 불구하고16,17,18,19,20,21,22,23,24, 인간에서 빈번하게 발생하는 MC 과정을 모방하고 그 병인이나 표적 치료와 같은 새로운 치료법을 연구하는 데 적합한 동물 실험 모델은 여전히 부족합니다. 현재까지 MC의 병리학적 기전을 연구하기 위해 보고된 동물 모델은 소수에 불과합니다.
본 연구는 Albert와 Ma가 제안한 자가면역 이론에 기반하여, 천공된 척추 종판 부근에 수핵(NP)을 자가이식하는 간단하고 재현성 있는 토끼 비만세포종(MC) 모델을 구축하였다. 다른 목적은 동물 모델의 조직학적 특성을 관찰하고 MC 발생에서 수핵의 구체적인 기전을 규명하는 것이다. 이를 위해 분자생물학, MRI, 조직학적 연구 등의 기법을 이용하여 MC의 진행 과정을 연구하였다.
수술 중 출혈로 두 마리의 토끼가 죽었고, MRI 촬영 중 마취로 네 마리의 토끼가 죽었습니다. 나머지 48마리의 토끼는 모두 생존했으며 수술 후 행동적 또는 신경학적 이상 징후를 보이지 않았습니다.
MRI 영상에서 각기 다른 구멍에 삽입된 조직의 신호 강도가 다르게 나타났다. NPE 그룹의 L5 척추체의 신호 강도는 삽입 후 12주, 16주, 20주에 걸쳐 점진적으로 변화하였다(T1W 시퀀스에서는 저신호, T2W 시퀀스에서는 저신호와 혼합 신호가 나타남)(그림 1C). 반면, 다른 두 그룹의 삽입 부위는 같은 기간 동안 MRI 영상에서 비교적 안정적인 모습을 보였다(그림 1A, B).
(A) 3개의 시점에서 촬영한 토끼 요추의 대표적인 연속 MRI 영상. 가짜 수술군 영상에서는 신호 이상이 관찰되지 않았다. (B) ME군의 척추체 신호 특성은 가짜 수술군과 유사하며, 매몰 부위에서 시간에 따른 유의미한 신호 변화는 관찰되지 않았다. (C) NPE군에서는 T1W 영상에서 저신호가 명확하게 나타나고, T2W 영상에서는 저신호와 혼합 신호가 명확하게 나타난다. 12주에서 20주까지 T2W 영상에서 저신호 주변의 산발적인 고신호가 감소하는 것을 관찰할 수 있다.
NPE 그룹에서는 척추체 이식 부위에서 뚜렷한 골 증식이 관찰되었으며, 12주에서 20주 사이에 골 증식이 더 빠르게 진행되었다(그림 2C). 반면, Sham 그룹과 ME 그룹에서는 모형화된 척추체에서 유의미한 변화가 관찰되지 않았다(그림 2C, 2A,B).
(A) 이식 부위의 척추체 표면이 매우 매끄럽고, 구멍이 잘 아물었으며, 척추체 내에 골증식이 관찰되지 않았다. (B) ME 그룹의 이식 부위 형태는 가짜 수술 그룹과 유사하며, 시간이 지나도 이식 부위의 외형에 뚜렷한 변화가 없었다. (C) NPE 그룹의 이식 부위에는 골증식이 발생했다. 골증식은 급속도로 증가하여 추간판을 통과해 반대쪽 척추체까지 확장되었다.
조직학적 분석은 골 형성에 대한 보다 자세한 정보를 제공합니다. 그림 3은 H&E 염색을 한 수술 후 조직 단면 사진입니다. 가짜 수술군에서는 연골세포가 잘 배열되어 있었고 세포 증식은 관찰되지 않았습니다(그림 3A). ME군의 상황도 가짜 수술군과 유사했습니다(그림 3B). 그러나 NPE군에서는 이식 부위에 다수의 연골세포와 NP 유사 세포의 증식이 관찰되었습니다(그림 3C).
(A) 종판 부근에서 골소주가 관찰되며, 연골세포는 균일한 크기와 모양으로 가지런히 배열되어 있고 증식은 보이지 않는다(40배). (B) ME군의 이식 부위 상태는 대조군과 유사하다. 골소주와 연골세포가 보이지만 이식 부위에서 뚜렷한 증식은 관찰되지 않는다(40배). (B) 연골세포와 수핵 유사 세포가 현저하게 증식했으며, 연골세포의 모양과 크기가 불규칙한 것을 볼 수 있다(40배).
NPE군과 ME군 모두에서 인터루킨 4(IL-4) mRNA, 인터루킨 17(IL-17) mRNA, 인터페론 γ(IFN-γ) mRNA의 발현을 관찰하였다. 표적 유전자의 발현 수준을 비교한 결과, NPE군에서 IL-4, IL-17, IFN-γ의 발현이 ME군 및 대조군(가짜 수술군)에 비해 유의하게 증가하였다(그림 4) (P < 0.05). 대조군과 비교했을 때, ME군에서는 IL-4, IL-17, IFN-γ의 발현 수준이 약간 증가했을 뿐 통계적으로 유의한 차이는 없었다(P > 0.05).
NPE 그룹에서 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 mRNA 발현은 가짜 수술 그룹 및 ME 그룹에 비해 유의하게 높은 경향을 보였다(P < 0.05).
반면, ME 그룹의 발현 수준은 유의미한 차이를 보이지 않았다(P>0.05).
IL-4 및 IL-17에 대한 시판 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 mRNA 발현 패턴의 변화를 확인했습니다. 그림 5A,B에서 볼 수 있듯이, ME군 및 가짜 수술군과 비교했을 때, NPE군에서 IL-4 및 IL-17 단백질 수준이 유의하게 증가했습니다(P < 0.05). 그러나 가짜 수술군과 비교했을 때, ME군에서 IL-4 및 IL-17 단백질 수준은 통계적으로 유의미한 변화를 보이지 않았습니다(P > 0.05).
(A) NPE 그룹의 IL-4 및 IL-17 단백질 수치는 ME 그룹 및 위약 그룹보다 유의하게 높았다(P < 0.05). (B) 웨스턴 블롯 히스토그램.
수술 중 얻을 수 있는 인체 샘플의 수가 제한적이기 때문에 MC의 병인에 대한 명확하고 상세한 연구는 다소 어렵습니다. 이에 본 연구에서는 MC의 잠재적인 병리학적 기전을 연구하기 위해 동물 모델을 구축하고자 했습니다. 동시에, NP 자가이식으로 유발된 MC의 진행 과정을 방사선학적 평가, 조직학적 평가 및 분자생물학적 평가를 통해 추적 관찰했습니다. 그 결과, NP 이식 모델에서 12주에서 20주까지 신호 강도가 점진적으로 변화하는 양상(T1W 시퀀스에서 저신호, T2W 시퀀스에서 저신호가 혼합된 양상)이 관찰되었으며, 이는 조직 변화를 나타내는 소견입니다. 조직학적 및 분자생물학적 평가 결과는 방사선학적 연구 결과와 일치했습니다.
본 실험 결과는 NPE 그룹의 척추체 침범 부위에서 시각적 및 조직학적 변화가 발생함을 보여줍니다. 동시에 IL-4, IL-17 및 IFN-γ 유전자의 발현과 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 발현 양상이 관찰되었는데, 이는 자가 수핵 조직의 척추체 침범이 일련의 신호 및 형태학적 변화를 유발할 수 있음을 시사합니다. 동물 모델의 척추체 신호 특성(T1W 시퀀스에서 저신호, T2W 시퀀스에서 혼합 신호 및 저신호)이 인간 척추 세포의 신호 특성과 매우 유사함을 쉽게 확인할 수 있으며, MRI 특성 또한 조직학적 및 육안 해부학적 관찰 결과와 일치하여 척추체 세포의 변화가 점진적임을 보여줍니다. 급성 외상으로 인한 염증 반응은 천자 직후 나타날 수 있지만, MRI 결과는 천자 후 12주가 지나서야 신호 변화가 점진적으로 증가하기 시작하여 20주까지 회복이나 MRI 변화의 역전 징후 없이 지속되는 것을 보여주었습니다. 이러한 결과는 자가 척추 수핵 이식이 토끼에서 점진적인 척추 운동성 변화를 유도하는 신뢰할 수 있는 방법임을 시사합니다.
이 천자 모델은 상당한 기술, 시간 및 외과적 노력을 요구합니다. 예비 실험에서 척추 주변 인대 구조의 절개 또는 과도한 자극은 척추 골극 형성을 초래할 수 있습니다. 인접한 디스크를 손상시키거나 자극하지 않도록 주의해야 합니다. 일관되고 재현 가능한 결과를 얻기 위해서는 천자 깊이를 조절해야 하므로, 3mm 길이의 바늘 피복을 잘라내어 수동으로 마개를 만들었습니다. 이 마개를 사용하면 척추체 내에서 균일한 천자 깊이를 확보할 수 있습니다. 예비 실험에서 수술에 참여한 세 명의 정형외과 의사는 18게이지 바늘이나 다른 방법보다 16게이지 바늘을 사용하는 것이 더 쉽다고 평가했습니다. 천자 중 과도한 출혈을 방지하기 위해 바늘을 잠시 고정하면 보다 적절한 삽입 구멍을 얻을 수 있으며, 이를 통해 일정 수준의 천자 깊이 조절이 가능함을 시사합니다.
MC를 표적으로 한 연구는 많았지만, MC의 원인과 병태생리에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.25,26,27 저희의 이전 연구에 따르면 자가면역이 MC의 발생과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다.12 본 연구에서는 항원 자극 후 CD4+ 세포의 주요 분화 경로인 IL-4, IL-17, IFN-γ의 정량적 발현을 조사했습니다. 연구 결과, 음성 대조군과 비교했을 때 NPE군은 IL-4, IL-17, IFN-γ의 발현이 높았으며, IL-4와 IL-17의 단백질 농도 또한 더 높았습니다.
임상적으로, 추간판 탈출증 환자의 수핵 세포(NP 세포)에서 IL-17 mRNA 발현이 증가하는 것으로 보고되었습니다.28 또한, 급성 비압박성 추간판 탈출증 모델에서 건강한 대조군에 비해 IL-4 및 IFN-γ 발현 수준이 증가한 것으로 나타났습니다.29 IL-17은 염증, 자가면역 질환에서의 조직 손상에 중요한 역할을 하며30, IFN-γ에 대한 면역 반응을 증강시킵니다.31 IL-17 매개 조직 손상 증강은 MRL/lpr 마우스32 및 자가면역 질환에 취약한 마우스33에서 보고되었습니다. IL-4는 염증성 사이토카인(IL-1β 및 TNFα 등)의 발현과 대식세포 활성화를 억제할 수 있습니다.34 NPE 그룹에서 IL-4 mRNA 발현은 동일 시점에서 IL-17 및 IFN-γ와 차이가 있었으며, NPE 그룹에서 IFN-γ mRNA 발현은 다른 그룹보다 유의하게 높았습니다. 따라서 IFN-γ 생성은 NP 삽입에 의해 유발되는 염증 반응의 매개체일 수 있습니다. 연구에 따르면 IFN-γ는 활성화된 1형 보조 T 세포, 자연 살해 세포 및 대식세포를 포함한 여러 세포 유형에서 생성되며35,36 면역 반응을 촉진하는 주요 전염증성 사이토카인입니다37.
본 연구는 자가면역 반응이 MC의 발생 및 발달에 관여할 수 있음을 시사합니다. Luoma 등은 MRI에서 MC와 돌출된 NP의 신호 특성이 유사하며, 둘 다 T2W 시퀀스에서 높은 신호를 나타낸다는 것을 발견했습니다.38 IL-139과 같은 일부 사이토카인은 MC 발생과 밀접한 관련이 있는 것으로 확인되었습니다. Ma 등은 NP의 상방 또는 하방 돌출이 MC의 발생 및 발달에 큰 영향을 미칠 수 있다고 제안했습니다.12 Bobechko40 및 Herzbein 등41은 NP가 출생 시부터 혈관 순환계로 들어갈 수 없는 면역 관용 조직이라고 보고했습니다. NP 돌출부는 혈액 공급에 이물질을 유입시켜 국소 자가면역 반응을 매개합니다.42 자가면역 반응은 다수의 면역 인자를 유도할 수 있으며, 이러한 인자들이 조직에 지속적으로 노출되면 신호 전달에 변화를 일으킬 수 있습니다.43 본 연구에서 IL-4, IL-17 및 IFN-γ의 과발현은 대표적인 면역 인자이며, 이는 NP와 MC 사이의 밀접한 관계를 더욱 입증합니다.44 이 동물 모델은 신경핵(NP)의 돌파 및 신경근 접합부 진입을 잘 모방합니다. 이 과정을 통해 자가면역이 신경근 접합부에 미치는 영향도 밝혀졌습니다.
예상대로 이 동물 모델은 MC 연구를 위한 유용한 플랫폼을 제공합니다. 그러나 이 모델에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 첫째, 동물 관찰 단계에서 일부 중간 단계 토끼는 조직학적 및 분자생물학적 검사를 위해 안락사시켜야 하므로 시간이 지남에 따라 일부 동물은 더 이상 사용되지 않게 됩니다. 둘째, 본 연구에서는 세 시점을 설정했지만, 아쉽게도 한 가지 유형의 MC(Modic type I 변화)만 모델링했기 때문에 인간 질병 발달 과정을 충분히 나타내지 못하며, 모든 신호 변화를 더 잘 관찰하기 위해서는 더 많은 시점을 설정해야 합니다. 셋째, 조직 구조의 변화는 조직학적 염색을 통해 명확하게 확인할 수 있지만, 일부 특수 기술은 이 모델에서 미세 구조 변화를 더 잘 보여줄 수 있습니다. 예를 들어, 편광 현미경은 토끼 추간판에서 섬유연골 형성을 분석하는 데 사용되었습니다.45 NP가 MC와 종판에 미치는 장기적인 영향에 대해서는 추가 연구가 필요합니다.
체중 약 2.5~3kg, 생후 3~3.5개월 된 뉴질랜드 흰토끼 수컷 54마리를 무작위로 대조군, 근육 이식군(ME군), 신경근 이식군(NPE군)으로 나누었다. 모든 실험 절차는 톈진 병원 윤리위원회의 승인을 받았으며, 실험 방법은 승인된 지침을 엄격히 준수하여 수행되었다.
S. Sobajima 46의 수술 기법에 몇 가지 개선 사항이 적용되었습니다. 각 토끼를 측와위 자세로 놓고 후외측 복막 접근법을 사용하여 연속된 5개의 요추 추간판(IVD)의 전면을 노출시켰습니다. 각 토끼에게 전신 마취(20% 우레탄, 5ml/kg, 귀 정맥을 통해 투여)를 시행했습니다. 늑골 하단에서 골반 가장자리까지, 척추 주변 근육에서 2cm 아래쪽에 세로 방향의 피부 절개를 했습니다. 상부 피하 조직, 복막 조직 및 근육을 예리한 기구와 둔한 기구를 사용하여 박리하여 L1에서 L6까지의 우측 전외측 척추를 노출시켰습니다(그림 6A). 골반 가장자리를 L5-L6 추간판 레벨의 해부학적 기준점으로 사용하여 추간판 레벨을 결정했습니다. 16게이지 천자침을 사용하여 L5 척추의 종판 근처에 3mm 깊이로 구멍을 뚫습니다(그림 6B). 5ml 주사기를 사용하여 L1-L2 추간판에서 자가 수핵을 흡인합니다(그림 6C). 각 그룹의 요구 사항에 따라 수핵 또는 근육을 제거합니다. 구멍을 깊게 뚫은 후, 흡수성 봉합사를 사용하여 심부 근막, 표층 근막 및 피부를 봉합하고, 수술 중 척추체의 골막 조직이 손상되지 않도록 주의합니다.
(A) 후외측 복막후 접근법을 통해 L5-L6 디스크를 노출시킨다. (B) 16게이지 바늘을 사용하여 L5 종판 근처에 구멍을 뚫는다. (C) 자가 근섬유를 채취한다.
20% 우레탄(5ml/kg)을 귀 정맥을 통해 투여하여 전신 마취를 시행하였고, 수술 후 12주, 16주, 20주에 요추 방사선 촬영을 반복하였다.
수술 후 12주, 16주, 20주에 케타민(25.0mg/kg)을 근육 주사하고 펜토바르비탈나트륨(1.2g/kg)을 정맥 주사하여 토끼를 안락사시켰다. 척추 전체를 적출하여 조직학적 분석을 시행하고 실시간 분석을 실시했다. 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)과 웨스턴 블롯팅을 이용하여 면역 인자의 변화를 분석했다.
3.0 T 임상용 자기공명영상(MRI) 장비(GE Medical Systems, Florence, SC)와 직교형 사지 코일 수신기를 사용하여 토끼에서 MRI 검사를 시행했습니다. 토끼에게 귀 정맥을 통해 20% 우레탄(5 mL/kg)을 투여하여 마취한 후, 요추 부위가 직경 5인치 원형 표면 코일(GE Medical Systems) 중앙에 오도록 자기공명영상 장비 내에 앙와위 자세로 위치시켰습니다. 관상면 T2 강조 국소화 영상(TR, 1445 ms; TE, 37 ms)을 획득하여 L3-L4에서 L5-L6까지의 요추 디스크 위치를 확인했습니다. 시상면 T2 강조 영상은 다음과 같은 설정으로 획득했습니다. 고속 스핀 에코 시퀀스(반복 시간(TR), 2200 ms; 에코 시간(TE), 70 ms), 매트릭스; 시야 260도, 자극 8개; 절단 두께 2 mm, 간격 0.2 mm.
마지막 사진 촬영과 마지막 토끼 도살 후, 조직학적 검사를 위해 가짜 수술용 디스크, 근육에 포매된 디스크, 그리고 수핵 디스크를 적출했습니다. 조직은 10% 중성 완충 포르말린 용액에 1주일 동안 고정하고, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 탈칼슘 처리한 후 파라핀에 포매했습니다. 조직 블록을 파라핀에 포매하고 마이크로톰을 이용하여 시상면 절편(두께 5μm)으로 잘랐습니다. 절편은 헤마토실린-에오신(H&E) 염색을 시행했습니다.
각 그룹의 토끼에서 추간판을 채취한 후, 제조사의 지침에 따라 UNIQ-10 컬럼(Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., 중국)과 ImProm II 역전사 시스템(Promega Inc., Madison, WI, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출하고 역전사를 수행했습니다.
RT-qPCR은 Prism 7300(Applied Biosystems Inc., USA)과 SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행되었습니다. PCR 반응 부피는 20 μl였으며, 희석된 cDNA 1.5 μl와 각 프라이머 0.2 μM을 포함했습니다. 프라이머는 OligoPerfect Designer(Invitrogen, Valencia, CA)를 사용하여 설계하고 Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd.(중국)에서 제작했습니다(표 1). 열 순환 조건은 다음과 같습니다: 초기 중합효소 활성화 단계는 94°C에서 2분 동안 진행되었고, 이후 40주기 동안 각 주기마다 94°C에서 15초(주형 변성), 60°C에서 1분(어닐링), 신장, 그리고 72°C에서 1분 동안 형광 측정을 수행했습니다. 모든 샘플은 3회 증폭되었으며, 평균값을 RT-qPCR 분석에 사용했습니다. 증폭 데이터는 FlexStation 3(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)을 이용하여 분석했습니다. IL-4, IL-17, IFN-γ 유전자 발현은 내인성 대조군(ACTB)으로 정규화했습니다. 표적 mRNA의 상대적 발현 수준은 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 계산했습니다.
조직 균질기를 사용하여 RIPA 용해 완충액(프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 함유)에서 조직으로부터 총 단백질을 추출한 후, 4°C에서 20분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하여 조직 파편을 제거했습니다. 각 레인에 50μg의 단백질을 로딩하고 10% SDS-PAGE로 분리한 후 PVDF 멤브레인으로 전사했습니다. 실온에서 1시간 동안 0.1% Tween 20을 함유한 트리스 완충 식염수(TBS)에 5% 탈지분유를 넣어 블로킹했습니다. 멤브레인을 토끼 항-데코린 1차 항체(1:200 희석; Boster, Wuhan, China) 및 (1:200 희석; Bioss, Beijing, China)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 반응시켰습니다. 실온에서 1시간 동안 2차 항체(염소 항토끼 면역글로불린 G, 1:40,000 희석)와 과산화효소(Boster, Wuhan, China)를 함께 사용하여 반응시켰다. 웨스턴 블롯 신호는 X선 조사 후 화학발광막에서 증가된 화학발광을 통해 검출하였다. 밀도 측정 분석을 위해 블롯을 스캔하고 BandScan 소프트웨어를 사용하여 정량화하였으며, 결과는 표적 유전자 면역반응성과 튜불린 면역반응성의 비율로 나타냈다.
통계 분석은 SPSS 16.0 소프트웨어 패키지(SPSS, 미국)를 사용하여 수행했습니다. 연구 기간 동안 수집된 데이터는 평균 ± 표준편차(평균 ± SD)로 나타냈으며, 두 그룹 간의 차이를 확인하기 위해 일원 반복 측정 분산 분석(ANOVA)을 사용했습니다. P < 0.05인 경우 통계적으로 유의미하다고 판단했습니다.
따라서, 자가 유래 나노입자를 척추체에 이식하고 거시해부학적 관찰, MRI 분석, 조직학적 평가 및 분자생물학적 분석을 수행하여 MC 동물 모델을 확립하는 것은 인간 MC의 메커니즘을 평가하고 이해하며 새로운 치료법을 개발하는 데 중요한 도구가 될 수 있다.
이 논문을 인용하는 방법: Han, C. et al. 요추의 연골하골에 자가수핵을 이식하여 Modic 변화의 동물 모델을 확립했습니다. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., 및 Boos, N. 요추 자기공명영상: 무증상 자원봉사자에서 디스크 탈출 및 유지, 신경근 압박, 종판 이상 및 후관절 골관절염의 유병률. 비율. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, 및 Leboeuf-Eed, K. Modic 변화와 임상 소견과의 관계. European Spine Journal: European Spine Society, European Society of Spinal Deformity, and European Society for Cervical Spine Research의 공식 간행물 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. 요추 종판의 Modic 변화: 중년 남성 근로자의 요통 및 좌골신경통의 유병률 및 연관성. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., 및 Dalinka, M. 요추 퇴행성 질환에서 종판 근처 골수 변화의 MRI. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, 및 Carter, JR 퇴행성 디스크 질환: MRI를 이용한 척추 골수 변화 평가. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, 및 Carter, JR 퇴행성 디스크 질환의 영상. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. 일반 인구에서 신척추 종판(Modic) 신호 변화의 예측인자. European Spine Journal: European Spine Society, European Society of Spinal Deformity, and the European Society for Cervical Spine Research, Division 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB 및 Mannisch, K. 요추 디스크 탈출 후 Modic 변화. European Spine Journal : 유럽 척추 학회, 유럽 척추 변형 학회 및 유럽 경추 연구 학회의 공식 간행물 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., 및 Kaapa, E. Modic 유형 I 변화는 급속히 진행되는 변형성 디스크 퇴행을 예측할 수 있습니다: 1년 전향적 연구. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ 및 Fan, SW Modic 변화: 요추 디스크 퇴행의 가능한 원인 및 기여. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV 내부 디스크 파열. 50년 이상 디스크 탈출 문제. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
게시 시간: 2024년 12월 13일